まず、リポソームのアリコートを室温の水浴に入れて小胞を解凍します。バッファーAでフィルターを取り付けた押出機を事前に平衡化し、解凍したリポソームを押出機に13回通します。押し出されたリポソームをプラスチックチューブに集め、デッドボリュームを最小限に抑えます。
次に、希釈したリポソーム溶液1ミリリットルを透明なキュベットにピペットで入れます。分光光度計で540ナノメートルの初期光学密度を測定します。50マイクロリットルの10%Triton X-100をリポソームに加えます。
溶液が最大光学密度に達したら、Triton X-100に対して滴定し、光学濃度が60%の飽和度が得られるまで滴定します。洗剤で不安定になった小胞をプラスチックチューブに戻します。次に、精製した膜タンパク質を不安定化したリポソームに、所望の比率400対1が得られるまで添加する。
サンプルを摂氏4度で15分間定型化します。次に、洗浄密度の高い脱湿ポリスチレンビーズ200ミリグラムを追加して、洗剤を取り除きます。次に、氷の上に置かれた空の6.5ミリリットルの超中心化チューブの上に、空の10ミリリットルの重力流柱を固定します。
サンプルを重力フローカラムに注ぎ、超遠心チューブにプロテオリポソームを回収します。ビーズに0.5ミリリットルのバッファーAを追加します。濾液を超遠心チューブに集めます。
次に、リポソームを超遠心分離機に入れて濃縮します。上清を廃棄した後、ペレット化したプロテオリポソームを総量200マイクロリットルのバッファーAに再懸濁します。Triton X-100の量が少ないと、最初は540ナノメートルで吸光度が増加しました。
さらに添加すると、小胞が部分的に可溶化しました。私たちのRsolでは、リポソームは完全に可溶化されました。
