まず、層流エアフローキャビネットのスイッチを入れ、3分間安定させます。キャビネットの内面を無菌的に清掃し、消毒するには、以下の消毒剤を使用します。キャビネットに入る材料を消毒した後、ナプキンとニトリル手袋をキャビネットに入れます。
次に、キャビネットの電源を切り、紫外線に15分間さらします。照射後、キャビネットを再起動します。プライマーデザイン試薬を氷で満たされたクーラーに入れます。
70%エタノールで消毒した後、容器をキャビネット内に置きます。ループ媒介等温増幅(LAMPミックス)を0.6ミリリットルの微量遠心チューブで調製します。混合物をピペットで動かして均質化します。
次に、閉じたチューブを摂氏95度の加熱ブロックで5分間インキュベートします。次に、氷を充填したポリスチレンクーラーでチューブを5分間冷却します。冷却後、チューブを層流キャビネットに入れます。
LAMPミックスを完成させるには、4マイクロリットルのDNAポリメラーゼを加え、続いて1マイクロリットルの逆転写酵素を加えます。比色検出を行うには、ジヒドロキシナフトールブルーを追加します。試薬を添加した後、各溶液をピペットで動かして、LAMP試薬を適切に混合します。
次に、22マイクロリットルの溶液をPCRチューブにピペットで入れ、泡を作らないように注意します。ネガティブコントロールには、0.1%ジエチルピロカーボネート水3マイクロリットルを追加します。遺伝物質の追加のために残りのチューブを取っておきます。
次に、キャビネットからすべての材料を取り除きます。キャビネットの表面を70%エタノールで消毒した後、電源を切ります。別の領域で、各PCRチューブに3マイクロリットルのサンプルを追加し、20マイクロリットルのマイクロピペットでウェルをピペットして完全に均質化します。
比色反応を開始する前に、高品質のカメラを使用してPCRチューブの写真を撮ります。次に、サーマルサイクラーとウォーターバスを使用して反応を行います。サーマルサイクラーの場合、チューブを反応ブロックに配置し、装置にサーモプロファイルを設定します。
ウォーターバスを使用する場合は、チューブを円形の容器にしっかりと置き、これらの容器を摂氏66.3度のウォーターバスに60分間入れます。反応時間が経過したら、チューブを取り外し、使用するまで摂氏4度で保管します。比色反応を行った場合は、高品質のカメラでPCRの画像を撮影します。
温度勾配により、最適な融解温度は摂氏66.3度であることが示されました。BST 3.0酵素の濃度は、マイクロリットルあたり3.2国際単位に最適化されました。比色戦略を定義するために、中性赤色色素中のフェノールレッドを評価しました。
しかし、増幅後の色の変化は観察されませんでした。ヒドロキシナフトールブルーの異なる濃度の標準化が行われ、125マイクロモルのヒドロキシナフトールブルーで最適な変化が起こりました。増幅されたサンプルは、その濃度に応じて色の変化を示しました。
サンプルの増幅は、電気泳動によってさらに確認されました。
