腱の研究と工学のための成人正常ヒト皮膚線維芽細胞の2D拡張、2D刺激、および3Dオルガノイド成熟

まず、遠心分離機で正常なヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン化しました。遠心分離したチューブから上清を取り除きます。予熱した添加したDMEM低グルコース培地をペレットに加え、よく混ぜて再懸濁します。

正常なヒト真皮線維芽細胞を10cmの接着細胞培養皿に播種します。皿を横にそっと揺らします。14日間の2D刺激の後、細胞がコンフルエントになったら、培地を吸引し、細胞スクレーパーを使用して、形成された細胞シートを皿から穏やかかつ迅速に剥離します。

同時に、細胞シートを3D棒状のオルガノイドに丸めます。正常なヒト真皮線維芽細胞オルガノイドを、幅10cmの非接着性ペトリ皿に移します。定規で伸びを測定します。

次に、オルガノイドの片側をピンセットで持ち、オルガノイドが軸方向に約10%伸びるまでゆっくりと伸ばしますピンセットを使用して、オルガノイドの両端からプラスチック皿に金属ピンを手動で押し下げて固定します。最後に、3D熟成のために、インキュベーション前に10ミリリットルの予熱済み補充DMEM高グルコース培地を加えます。3D成熟ステップの0日目と14日目の3Dオルガノイドの全体的な形態は、輝く白い外観を示しました。

時間が経つにつれて、オルガノイドは収縮し、密度が高く見えました。オルガノイドの形態は、HE染色を使用して評価されました。初日、オルガノイドは、主に少量のマトリックスに囲まれた細胞で構成される切断された層を示しました。

層内の細胞は、丸い形をしたさまざまなサイズの核を示しました。14日目には、エオシンシグナルの顕著な増加が観察され、マトリックスの沈着と融合層が示されました。さらに、オルガノイドは、整列した細胞を含む領域の存在を示しました。

核の大部分は同様のサイズを持ち、時には細長いこともありました。