まず、マイクロスライドの18ウェルガラス底チャンバーを取り、チャンバーの各ウェルに150マイクロリットルの水酸化ナトリウムを加え、室温で1時間インキュベートします。次に、水酸化ナトリウム溶液を取り除き、脱イオン水でウェルを3〜5回洗浄し、続いて10ミリモルの塩化カルシウムを含むバッファーで3回洗浄します。次に、10ミリモルの塩化カルシウムを含む150マイクロリットルの緩衝液を含むウェルに、準備したばかりのSUV15マイクロリットルを追加します。
室温で30分間インキュベートした後、塩化カルシウムを含まないバッファーでSLBを少なくとも7回洗浄します。ビオチン化SLBをストレプトアビジンで官能基化するためには、ストレプトアビジン溶液を添加します。次に、SLBをバッファーで少なくとも5回洗浄して、余分なストレプトアビジンを除去します。
次に、b-disiLIDをウェルの最終濃度1マイクロモルに添加します。室温で30分間インキュベートした後、余分なタンパク質をバッファーで少なくとも5回洗浄します。次に、mOrange-Nanoを最終濃度200ナノモルまで添加します。
サンプルをアルミホイルで覆い、暗所に保管します。その後、マイクロスライドを蛍光顕微鏡の下に置きます。552ナノメートルレーザーをセットして、mOrange-Nanoを視覚化します。
蛍光顕微鏡法により、b-disiLIDで官能基化されたSLB上にmOrange-Nanoがパターン化されていることが明らかになりました。光活性化後、関心領域内のオレンジチャネルの蛍光シグナルが急速に増加します。mOrange-Nanoの蛍光は、各光活性化が120秒で飽和した後に増加し、その後120秒でバックグラウンドレベルまで減少します。
