まず、マウスの二次リンパ組織から単離された生きたTリンパ球のタイムラプスイメージングを行います。T細胞の遊走解析を行うには、Velocityソフトウェアを開き、新しい画像シーケンスを作成します。オールタイムラプスビデオ顕微鏡動画を選択して、Velocityの青い領域に移動します。
コントラスト強調ツールを使用して、明るさとコントラストを変更し、画像サイズを20倍の場合は0.325マイクロメートルに、10倍の倍率の場合は0.65マイクロメートルに調整します。タイムポイントを設定するようにシーケンスを設定したら、[測定]タブに移動し、すべてのタイムポイントのチェックを外します。次に、強度を使用してオブジェクトを見つけ、バーをピークの右側にスライドさせます。
細胞の破片を避けるために、直径が10マイクロメートル未満で直径が100マイクロメートルを超えるすべての細胞を除外します。[静的オブジェクトを無視する]をオンにし、その後に壊れたトラックを自動的に結合します。新しいプロトコルを保存するには、測定に進みます。
「プロトコルの保存」をクリックし、続いて「新しいプロトコルに名前を付ける」をクリックします。[測定]タブで、[すべてのタイムポイントの測定]をクリックし、トラックを期間の高いものから低いものへと並べ替えます。良好なトラックを持つセルのトラックID番号を記録した後、ファイルをカンマ区切りテキストとしてエクスポートし、目的の分析ソフトウェアにデータを転送します。
手動トラッキングを実行するには、画像 J を開き、プラグインに移動して、トラッキングと手動トラッキングを選択します。X x Y キャリブレーション、ピクセル サイズ、Z キャリブレーションの時間間隔を設定します。次に、「トラックの追加」をクリックして、個々のセルの追跡を開始します。
最初の時点の 1 つのセルを選択し、すべての時点までセルを続けます。最後に、エンドトラックをクリックします。ソフトウェア支援の細胞追跡は、異なる色の線で示されるように、活性化された個々のT細胞の遊走行動を特徴付けました。
