細胞内の正確なグルタチオン検出のためのOPAアッセイ

まず、アッセイに必要なすべての材料を準備します。GSH標準では、各ウェルに40マイクロリットルの総グルタチオン緩衝液を添加します。次に、細胞ペレットを含むプレートの各ウェルから培地を吸引し、細胞を氷冷PBSで3回洗浄します。

10マイクロリットルのグルタチオンと二重蒸留水で、三重にブランクとして校正範囲を準備します。目的のターゲット定量を行うには、洗浄した細胞を適切な混合物と適切な混合物と共にオービタルシェーカーで 300 RPM で 2 分間インキュベートします。次に、5マイクロリットルの0.01モルトリス、2-カルボキシエチルホスフィン溶液を各ウェルに加え、再度10分間インキュベートします。

次に、プレートを200 Gで5分間遠心分離し、各サンプルウェルから25マイクロリットルを別々の透明な96ウェルプレートに移してタンパク質定量を行います。次に、170マイクロリットルのオルトフタルアルデヒド溶液を、30マイクロリットルのサンプルを含む各ウェルに加えます。プレートを光から保護するために、プレートをホイルで完全に覆い、オービタルシェーカーで15分間インキュベートします。

最後に、プレートリーダーを使用して、340ナノメートルの励起と450ナノメートルの発光で蛍光を読み取ります。さまざまなナノ材料で処理したA549細胞は、このアッセイで異なるグルタチオンジスルフィド比を示し、銀1ミリリットルあたり125マイクログラムで処理した細胞で最も高い値が観察されました。