まず、タンパク質-リガンド複合体を含むサンプルを調製します。次に、ピペットを使用して、調製した溶液0.6ミリリットルを5ミリリットルのNMRチューブに慎重に移します。NMR装置を必要な温度に設定するには、EDTコマンドを使用して温度制御モニターを開き、希望の温度を調整します。
次に、サンプルをサンプルチェンジャーに置きます。オートサンプラーを使用してサンプルを磁石に挿入し、コマンドsxを実行し、その後にオートサンプラートレイ内のNMRチューブの位置に対応する位置番号Nを実行します。この後、サンプルはNMR磁石に入ります。
溶媒信号をロックオンするには、lock コマンドを入力し、メニューから適切な溶媒を選択します。自動モジュール atma または手動モジュール atmm のいずれかを使用して、チューニングとマッチングのプロセスを完了します。次に、topshimコマンドを使用して自動シミングを開始し、次にpulsecalコマンドを実行して陽子90度のパルスを決定します。
その後、新しいデータセットを作成し、STD NMRパルスシーケンスをアップロードします。STD NMR実験のオフとオンの共鳴周波数を、ACQUPARSウィンドウのFQLISTエントリで定義します。リガンドやタンパク質のプロトンシグナルがない領域でオフ共鳴周波数を設定します。
次に、糖鎖シグナルのないスペクトル領域のオン共鳴周波数を選択します。飽和時間中に使用される整形パルスを、ASEDウィンドウのACQUPARSパラメータで定義します。その後、陽子のパルス長を90度に設定し、総飽和時間と緩和遅延を3秒に調整します。
スキャンの数を 8 の倍数に設定し、ダミー スキャンを 8 に設定します。次に、F2 のポイント数を 16K、32K、または 64K に設定し、F1 を 2 に設定します。次に、自動コマンドrgaを使用して、オーバーフローを避けるためにレシーバーゲインを設定します。
experiment コマンドを使用して、合計実験時間を計算します。最後に、zg コマンドを使用して、集録のために実験を送信します。実験後、最初のFIDのフーリエ変換を実行し、処理されたスペクトルの目的地を選択します。
次に、lb コマンドを使用して、線幅拡大係数を調整します。スペクトラムを手動で位相化するには、プロセスタブにアクセスし、次に位相調整サブメニューにアクセスします。対応するボタンをクリックしてドラッグし、ゼロ次と1次補正を実行し、フェーズ結果を保存します。
2 番目の実験でフーリエ変換を実行した後、処理されたスペクトルを別のコードで保存します。処理された 2 つのスペクトルに複数の関数を読み込み、複数の可視化で使用可能な減算ボタンを使用して、それらを減算します。次に、オフレゾナンススペクトラムを開き、MDコマンドを実行してマルチプルディスプレイウィンドウを開始します。
続いて、STDスペクトルをアップロードします。次に、STD NMRスペクトルに存在する信号の周波数と強度の比較分析を行います。オフ共振実験では、信号強度を測定します。
メニューをナビゲートしてプロセスを選択し、統合します。関心領域を慎重に定義し、積分をファイルに記録します。同様に、STD NMR実験で強度を測定し、同一のパラメータが使用されていることを確認し、これらの積分を別のファイルに文書化します。
あるいは、STDとオフ共鳴スペクトル間の信号強度を比較することで、STD値を決定することもできます。相対的なSTDをパーセンテージで計算するには、STD強度が最大になる陽子に100%の値を割り当てます。N-アセチルラクトースアミンとヒトガレクチン7との相互作用のプロトンSTD NMRスペクトルは、結合を示すSTD NMRシグナルを示しました。
さらに、タンパク質と密接に接触したプロトンに属するシグナルが現れ、結合エピトープの描写が可能になりました。
