まず、50ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、低タンパク質結合性のポリエーテルスルホンまたはポリフッ化ビニリデン0.45マイクロメートルの滅菌フィルターをシリンジの端に挿入します。25ミリリットルの血清学的ストリペットを使用して、細胞懸濁液HEK293Tトランスフェクトしたレンチウイルスをシリンジに加え、プランジャーを静かに戻します。プランジャーをゆっくりと押し、濾液を新しい50ミリリットルのチューブに集めます。
完了したら、フィルターをシリンジから取り外し、除染液に廃棄します。20%スクロース溶液を3ミリリットル超遠心チューブの底に加えます。次に、PIPETBOYを最低速度に設定します。
超遠心チューブを約45度の角度で保持し、ろ過したレンチウイルス含有培地をチューブ壁にゆっくりと加えます。チューブから層が明確に分離されているのを観察します。チューブの総容量が29ミリリットル未満の場合は、スピン中にチューブが崩壊しないように、新しいcDMEMを追加します。
超遠心分離機のバケツを70%アルコールで拭き、チューブアダプターをバケツの底に入れます。次に、超遠心チューブをバケツに入れます。バケットを閉じて、ラックに入れます。
超遠心分離機を摂氏4度に予冷します。バケツをローターに慎重に置き、掃除機をオンにします。加速率と減速率を最低設定に調整し、摂氏 4 度で 90 分間 26 、 000 RPM で遠心分離します。
遠心分離後、真空をオフにし、サンプルを乱さないようにローターを慎重に取り外します。超遠心分離機を観察して、バケツからのこぼれや漏れがないことを確認します。超遠心チューブの内容物を1回の滑らかな動きで廃棄物容器に注ぎます。
チューブを2層のティッシュペーパーに10分間ひっくり返します。その間、バケツの内側を70%エタノールに浸したティッシュペーパーで拭き、逆さまにして風乾します。ティッシュペーパーを使用して、超遠心チューブの縁に残っている液体を注意深く乾かします。
ペレットを1ミリリットルの適切な無血清培地に再懸濁し、15分間放置します。.1ミリリットルのピペットを使用して、レンチウイルス製剤を穏やかに混合し、1.5ミリリットルのスクリュートップチューブに分注します。レンチウイルス製剤は摂氏マイナス80度で保管してください。
レンチウイルスの調製に成功し、5マイクロリットルの用量で95%以上の感染率を達成しました。感染細胞の平均蛍光強度は、高用量で増加します。100マイクロリットルのレンチウイルス製剤の腹腔内注射では、マウスの腹膜細胞において最も高い割合と強度のGFPシグナルが得られました。
100マイクロリットルのレンチウイルス注射による経時的な実験では、3日目と7日目にGFPを発現する常在細胞がかなりの割合で存在し、続いて14日目に感染集団が消失したことが明らかになりました。
