まず、冷たい解剖培地が入った皿で子犬の背骨の腰部を取得します。解剖実体顕微鏡とマイクロハサミを使用して、矢状軸に沿って背骨を切断します。ストレートピンセットで、脊髄を背骨腔からそっと取り除き、脊髄の孤立した腰部、またはSCから髄膜を慎重に剥がします。単離されたSC腰部を冷たく新鮮な解剖培地に移し、10〜15分間インキュベートします。
プラスチック製のパスツールピペットを使用して、ティッシュをチョッパー器具のカッティングデッキにブレードに対して垂直に置きます。残留解剖媒体を取り除いた後、SCの自動切片化に進みます。パスツールピペットを使用して、スライスを移し、新鮮な解剖培地と35mmの皿で15分間インキュベートします。培養メンブレンインサートの表面を器官型培地(OM)で3回洗浄し、メンブレンインサートの底に1ミリリットルの培地を残します。
解剖実体顕微鏡でスライスを調べ、コンディショニングされたメンブレンインサートに必要な数のスライスを播種します。スライスの向きを調整し、余分な培地を取り除いた後、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、インサートを新しいペトリ皿に移し、メンブレンインサートの底にGDNFを添加した新鮮なOMを1ミリリットル追加します。
スライスを摂氏37度でインキュベートします。ex vivo oneの日に、古い培地を新しいOMに交換します。3日目に、GDNFを添加したグラフト培地に切り替え、ex vivo 7日目まで毎日新鮮なGDNFを培地に加えます。残りの長期培養では、培地を変更した場合にのみGDNFを追加します。
長期培養マウスSC器官型スライスの免疫蛍光アッセイにより、細胞骨格マーカーのニューロフィラメントと核ニューロンマーカーのRBFOX3が広く分布していることが明らかになり、それらの健康状態とニューロンの同一性が証明されました。
