ナノ秒パルス電場刺激のための凍結保存RSC96細胞の調製

まず、1ミリリットルのRSC96細胞懸濁液が入ったクライオバイアルを摂氏37度の水浴に入れ、急速に振とうします。細胞懸濁液を4〜6ミリリットルの完全培地を含む遠心分離チューブに移し、よく混合します。チューブを1, 000Gで3〜5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を3ミリリットルの完全培地に再懸濁します。

次に、628ミリリットルの完全培地を含む培養フラスコに細胞懸濁液を加え、摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞密度が80〜90%に達したら、培地を廃棄し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないPBSで細胞を1〜2回すすぎます。次に、0.25%トリプシン、0.53ミリモルEDTAを培養フラスコに加えます。

インキュベーションの終了時に、顕微鏡で細胞の剥離を観察します。ほとんどのセルが丸くなって分離したら、フラスコをすばやく作業領域に戻し、軽くたたきます。10%FBSを含む3〜4ミリリットルの培地を加えて消化を止めます。

次に、フラスコの内容物を完全に混合し、溶液を吸引します。細胞懸濁液を遠心分離します。1, 000G を 5 分間追加します。

上清を捨てた後、穏やかにピペッティングしながら、細胞を1〜2ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。細胞懸濁液を新しいT25フラスコに移します。1対2の比率を加え、7ミリリットルの培地を加えます。