まず、HEK 293 T細胞をトランスフェクションします。トランスフェクションの3日後、培地をウェルから取り出し、PBSで1回洗浄します。各ウェルに500マイクロリットルのトリプシンを追加します。
摂氏37度で5分間インキュベートし、プレートからすべての細胞を剥離します。次に、500マイクロリットルの完全DMEM培地を各ウェルに加え、細胞を再懸濁します。各ウェルのすべての細胞を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。
その後、室温で1, 000 gで2分間遠心分離します。ピペッティングで上清を慎重に取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSで一度洗浄します。再度、上清を慎重に除去し、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
細胞をFACSチューブに移します。フローサイトメーターを使用して細胞をアッセイします。未切除の細胞懸濁液をロードします。
フローサイトメトリーのワークシートで、Acquireを押し、順方向および側方散乱光電圧を調整します。セルを中央領域に配置するには、この集団R1の周囲にゲートを配置して、左下の象限の破片を除外します。FL1、FL2ドットブロットのゲートをGR1に変更します。クワッドゲーティングツールを選択し、FL1/FL2ドットブロットの細胞集団の右上端をG R1としてクリックします。FL1/FL2電圧を調整して、セルを左下の象限に配置します。
Pause and Abort を押します。次に、GFP単色制御セルをロードします。Acquire(アクイジション)を押して補正を調整し、GFP陽性細胞を右下の象限に配置します。
Pause and Abort を押します。次に、mCherry単色制御セルをロードします。Acquireを押し、補正を調整して、mCherry陽性セルを左上の象限に配置します。
Pause and Abort を押します。メニュー バーの [Acquire] をクリックし、[Acquisition Storage] を選択します。収集基準で、「G1 R1 イベントの 10, 000 がカウントされると取得が停止する」を選択します。
[セットアップ]のチェックマークを外します。サンプルセルをロードします。Acquireを押して、10, 000個のG1 R1セルがカウントされるまで待ちます。
他のサンプルやコントロールについても同じことを繰り返します。
