まず、すべてのFAXファイルを分析ダッシュボードにインポートします。ファイルの 1 つを開いて、前方散布図の側面散布図を表示します。ポリゴンゲートを作成して、プロットの左下隅に破片が入らないように、無傷のセルを分離します。
部分集団を無傷の細胞としてラベル付けし、このゲートをすべてのサンプルバーにドラッグします。各サンプルのゲートを確認するには、次のサンプル ボタンを使用します。ネガティブコントロールサンプルのインタクトセルサブポピュレーションをダブルクリックして、新しいプロットを表示します。
プロット軸を X 軸上の FL1-H に調整して GFP を表し、Y 軸上の FL2-H を mCherry に合わせます。次に、クワッドゲーティングツールを選択し、負の細胞集団の右上の端をクリックします。4 つの四角形のゲートをそのままのセル バーにドラッグします。
GFPまたはmCherryの単色コントロールの各サンプルを調べて、次のサンプルボタンを使用して正しいゲートを確認します。レイアウトエディタに移動します。ここでは、代表的なプロットを選択し、レイアウトエディタにコピーを選択します。
代表的なプロットをすべて選択し、ダブルクリックしてグラフ定義を開きます。X 軸ラベルに GFP と名前を付け、Y 軸ラベルに mCherry という名前を付けます。同じプロット内のGFP陽性細胞の数とmCherry陽性細胞の数を比較することにより、相対的なDNA修復効率を決定します。
NHEJおよびHR分析の精度を確保するために、適切な報酬調整およびゲーティング戦略が実施されました。この戦略では、GFP陽性細胞を右下の象限に、mCherry陽性細胞を左上の象限に配置しました。GFP陽性細胞の割合は、DNA DSBの修復効率とトランスフェクション効率を示しました。
逆に、mCherry陽性細胞の割合はトランスフェクション効率のみを反映していました。DNA DSBの修復効率は、GFP陽性細胞とmCherry陽性細胞の比率として計算されました。さらに、DNA修復におけるWiskott-Aldrich症候群タンパク質およびSCAR HumalogまたはWASHタンパク質の役割が、shCONTROLおよびshWASH細胞のNHEJアッセイを使用して実証されました。
WASHの喪失はNHEJの効率を低下させ、NHEJの促進におけるNHEJの役割を強調しています。
