シングルセルトランスクリプトミクスのための分化型3Dヒト腸オルガノイドからのシングルセル懸濁液の調製

まず、酵素細胞消化試薬を摂氏37度で30分間解凍します。10倍の倍率の明視野顕微鏡で、分化した3次元ヒト腸オルガノイドを観察し、細胞の健康を確保します。分化したオルガノイドを含む24ウェルプレートのウェルから培地を500マイクロリットルのコールドセル回収溶液と交換します。

ピペットで上下に動かして、細胞を基底膜から放出します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。チューブを氷上で10分間インキュベートし、5分ごとにピペッティングしてはピペッティングします。

細胞懸濁液を400gで摂氏4度で3分間遠心分離します。ペレットを乱さずにチューブから上清を取り除きます。ペレットを500マイクロリットルの予熱した酵素細胞消化試薬に再懸濁し、ピペッティングを10回上下します。

オルガノイドを37°Cで30分間、二酸化炭素インキュベーターに入れます。10分ごとに、P1000ピペットを使用して全容量を10回ピペットで移動し、細胞の解離を助けます。細胞懸濁液を400gで摂氏4度で3分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの分化培地に再懸濁します。

氷上で細胞を50回すばやく上下にピペットで動かし、オルガノイドを単一細胞に解離します。70 ミクロンのチップストレーナーで全容量をろ過し、溶出液を新しい 1.5 ミリリットルのチューブに集めます。次に、70ミクロンのストレーナで得られた溶出液を40ミクロンの先端ストレーナでろ過します。

5マイクロリットルの0.4%トリパンブルーを5マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、トリパンブルー排除を使用して生存可能な単一細胞をカウントします。サンプルを細胞培養培地で希釈して、マイクロリットルあたり1000個の細胞を得ます。合計4, 402の単一細胞が分化した回腸三次元ヒト腸オルガノイドから単離され、吸収性腸細胞や分泌細胞などの予想される細胞タイプを表しています。