まず、予熱した酵素細胞消化試薬が入った15ミリリットルのチューブを、使用するまで摂氏37度のインキュベーターに入れます。新たに調製したPBS/EDTAの500マイクロリットルを24ウェルプレートのウェルに分注します。明視野顕微鏡下で、分化した3次元ヒト腸オルガノイドおよびトランズウェルの成長を観察します。
細胞培養インサートを増殖培地からPBS/EDTA溶液に移します。頂端側から培地を取り出し、細胞層を乱さずに100マイクロリットルのPBS/EDTAと交換します。PBS / EDTAを廃棄した後、インサートをウェルから取り出し、ペーパータオルの端にそっと拭き取り、ベンチトップで反転させます。
鋭利なメスの刃を使用して、メンブレンの内周をカットして、インサートからメンブレンを取り除きます。鉗子でメンブレンを、200マイクロリットルの予熱酵素細胞消化試薬が入った1.5ミリリットルのチューブに移します。メンブレンを摂氏37度で30分間、二酸化炭素インキュベーターに置きます。
10分ごとに、P 200ピペットを使用して全容量を5回ピペットで挟みます。10分ごとに1〜2マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドガラスに移し、単一細胞の割合を定性的に評価することにより解離を評価します。解離後、条件ごとに3つの複製ウェルを1つの1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに結合します。
10マイクロモルのROCK阻害剤を含む細胞培養分化培地400マイクロリットルを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。70ミクロンのチップストレーナーで全容量をろ過し、流れを新しい1.5ミリリットルのチューブに集めます。次に、70ミクロンのストレーナで得られたフロースルーを40ミクロンの先端ストレーナでろ過します。
5マイクロリットルの0.4%トリパンブルーを5マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、生存可能な単一細胞をカウントします。サンプルをWRNE増殖培地で希釈して、マイクロリットルあたり1, 000個の細胞を取得します。膜細胞培養インサート上で増殖した分化した空腸ヒト腸オルガノイドから、合計5,623個の単一細胞を単離しました。
