96ウェル単分子膜として分化したヒト腸オルガノイドからの単一細胞懸濁液の調製

まず、ヒト腸管オルガノイド消化用の酵素細胞消化試薬とPBS/EDTAを調製します。明視野顕微鏡下で、分化した三次元ヒト腸オルガノイドの単層としての増殖を確認します。単層培養から細胞培養培地を廃棄し、100マイクロリットルのPBS/EDTAと交換します。

PBS/EDTAを除去した後、各ウェルに100マイクロリットルの温かい酵素細胞消化試薬を加えます。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターに置き、全容量を10分ごとに5回20〜30分間ピペットで回転させます。10分ごとに1〜2マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドガラスに移し、単一細胞の割合を観察して解離を評価します。

解離後、条件ごとに3つの複製ウェルを1つの1.5ミリリットル微量遠心チューブに結合します。10マイクロモルのROCK阻害剤を含む700マイクロリットルの細胞培養分化培地を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。70ミクロンの先端ストレーナーで全容量をろ過し、フロースルーを新しい1.5ミリリットルのチューブに集めます。

70ミクロンのストレーナで得られたフロースルーを、40ミクロンの先端ストレーナでろ過します。5マイクロリットルの細胞懸濁液に5マイクロリットルの0.4%トリパンブルーを加え、生存可能な単一細胞をカウントします。ROCK阻害剤を含む細胞培養培地でサンプルを希釈して、マイクロリットルあたり1, 000個の細胞を得る。

合計9,952個の単一細胞が、96ウェルプレートで増殖した分化したヒト腸オルガノイドから単離されました。