CRISPRベースモジュラーアセンブリ(CRISPRmass)によるUAS-cDNA/ORFプラスミドの大規模構築

CRISPRベースのモジュラーアセンブリまたはCRISPRmassの並列2ステップ試験管反応を行うには、試験管反応ステップ1でCas9 sgRNAによるcDNA/ORFプラスミドの同一のベクターバックボーンの切断に進みます。これを行うには、適切にラベル付けされた0.2ミリリットルのチューブを氷上のアルミニウム冷却ブロックに配置します。適量のCas9、sgRNA、Cas9バッファー、およびDEPC処理水を混合することにより、N回の反応用のマスターミックスを調製します。

マスターミックスの成分が一緒に追加されたら、適切な混合を確保するために同じものをボルテックスします。次に、混合物をスピンダウンし、マスターミックスの2マイクロリットルを各0.2ミリリットルのチューブに分注します。次に、0.019マイクロモルのcDNA/ORFプラスミドを0.4マイクロリットルを各チューブに加えます。

切断反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。次の試験管反応のステップ2では、得られたCas9直鎖状化cDNA/ORFプラスミドにベクター特異的なUASモジュールを挿入します。各サンプルの1.4マイクロリットルのシングルステップ反応を設定するには、ラベル付けされた0.2ミリリットルのチューブを氷上のアルミニウム冷却ブロックに配置します。

適切な量のUASモジュールとシングルステップ反応アセンブリマスターミックスを混合することにより、N個の反応のマスターミックスを調製します。ミックスを回転させる前に、よくボルテックスします。次に、0.77マイクロリットルのマスターミックスを各チューブに分注します。

各チューブのアリコートに0.7マイクロリットルのCas9直鎖状cDNA/ORFプラスミドを加え、摂氏50度で反応を1時間インキュベートします。