雌雄同体から配偶子束を採取し、淋菌サンゴ種から精子を採取した後、標識された50ミリリットルのチューブに入れます。4マイクロリットルの活性精子懸濁液をMakler計数チャンバーに置きます。精子の運動性を評価するには、活性化したサンプルの濃度を追加します。
coral biobanking auto-datasheetファイルを開き、コンピュータ支援精子分析評価に使用した精子希釈係数を入力します。次に、精子濃度、総運動性、および進行性運動性のコンピューター支援精子分析出力を入力します。ろ過した精子サンプルチューブに精子濃度を書き込み、チューブを凍結保存ワークステーションに移します。
共有のサンゴバイオバンキング自動データシートを開き、凍結保存タブを選択します。精子サンプルチューブのラベルを確認した後、コロニーIDを確認して対応するエントリを特定します.血清ピペットを使用して、精子サンプルを同じチューブに引き戻して排出することにより、精子サンプルの量を測定します。列Eに値を入力し、必要な凍結保護剤濃度の自動計算された列1と、追加する凍結希釈剤の量の列Hを確認します。
タイマーを開始します。そして、ピペットを使用して、サンプルを絶えず穏やかに混合しながら、クライオ希釈剤DMSOを滴下します。クライオ希釈液のエディションの時間をカラムP.ReadカラムKに記録して、充填するクライオバイアルの数を決定します。
滅菌バーコード付きクライオバイアルのキャップを外し、キャップを滅菌面に配置します。血清学的ピペットと分注ピペットを使用して、1ミリリットルのサンプルをバーコード付きのクライオバイアルとリキャップバイアルに分注します。1つの熱電対バイアルと充填されたすべてのサンプルバイアルを、室温で空のクライオラックインサートに入れます。
次に、ろ過された海水に10%DMSOを含むダミーのクライオバイアルをクライオラックの空のスロットに置きます。自動データシートの列Uにラン番号を入力し、クライオラックのシリアル番号を列Vにスキャンします。ロードしてスキャンしたラックは、凍結保護剤の残りの平衡化のために取っておきます。
クライオラックの冷却容器を液体窒素で満たし、毎分約20°Cで冷却します。10分間の凍結保護剤の平衡化期間の後、熱電対プローブをデータロガーに接続し、記録を開始します。フルクライオラックを冷却容器にそっと置き、蓋をします。
データロガーで熱電対バイアルが摂氏80度以下を示したら、クライオラックインサートを液体窒素浴に移してサンプルを急冷します。クライオバイアルをラックから取り出し、ドライシッパーに移してバイオバンクに輸送します。Acropora milleporaでは、固定カバースリップチャンバースライドは、Maklerカウントチャンバーと比較して精子濃度カウントの半分未満を示しました。
既知の濃度で市販のラテックスマイクロビーズを使用してMakler計数チャンバーを検証したところ、予想範囲内でばらつきが少なく、一貫した計数が得られました。凍結希釈剤として20%または30%DMSOを使用して凍結保存されたサンプル中の総精子、運動性精子、または進行性精子の融解後の濃度に有意差は観察されませんでした。
