まず、10%FBSを含むDMEM高グルコース培地を含む10層のセルファクトリーにHEK293T細胞を播種します。細胞を摂氏37度のインキュベーターに置き、5%の二酸化炭素を一晩補給します。次に、350ミリリットルのOpti-MEMを滅菌済みの500ミリリットルのボトルに分注します。
トランスフェクション用の血漿DNAをボトルに加え、振とうしてよく混ぜます。次に、15ミリリットルのPEI溶液をボトルに加えます。混合物を30秒間激しく振って、均一に混合されるようにします。
混合物を室温で15分間インキュベートした後、1リットルのボトルに移します。次に、700ミリリットルの低グルコースDMEMを追加します。10層セルファクトリーをインキュベーターから取り出し、培地を真空にして廃液容器に入れます。
DNAトランスフェクション混合物を慎重にピペットで細胞工場に送ります。その後、Cell Factoryをインキュベーターに72〜96時間戻します。3〜4日後、清澄化された上清を0.45μmのフィルターユニットでろ過します。
500ミリリットルのDPBSをセルファクトリーに追加してすすぎます。摂氏4度で20分間、4, 000 gで遠心分離します。真空システムと吸引ピペットを使用して、上清を取り除き、廃棄します。
20ミリリットルのAAV Lysis Bufferをペレットに加え、混合してペレットをバッファーに再懸濁します。精製するまでマイナス80°Cで保存してください。次に、40%PEG塩化ナトリウム溶液をAAV溶液に加え、最終濃度を最大8%PEGにします。
混合物を低速軌道回転子に摂氏4度で一晩置きます。溶液を4, 000gで摂氏4度で30分間遠心分離し、ウイルスを沈殿させます。上清をピペットで排出します。
次に、ペレットに5〜10ミリリットルのAAV HEPES再懸濁バッファーを入れました。懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、下流の精製を続けます。次に、10ミリリットルの注射器に取り付けた16ゲージのパント針を固定し、準備したヨージオキサノール勾配をラウンドトップポリプロピレン超遠心チューブに重ねます。
22ゲージの針で、グラジエントの上に最大17ミリリットルのAAV溶液を慎重に追加します。AAV Dialysis Bufferでチューブを補充します。電気シーラーでチューブを密封します。
チューブを350, 000 gで2時間、チタンローターで摂氏4度で遠心分離します。その後、超遠心チューブラックに移します。次に、新しい18ゲージの針を使用して、AAVウイルスを透析カセットに移します。
ウイルスをカセットに注入した後、カセットから空気を取り出します。AAV Dialysis Bufferが入ったビーカーに攪拌子を入れ、攪拌プレートに移します。次に、透析カセットをフロートブイ付きのバッファーに入れます。
10ミリリットルの注射器を使用して、カセットから遠心フィルターユニットにウイルスを移します。4, 000 gで摂氏4度で15〜30分間遠心分離します。濃縮されたAAVをフィルターユニットから収集します。
次に、300マイクロリットルのAAV透析バッファーでフィルターをすすぎます。最後に、リンス液を濃縮AAVに移します。単離されたAVVウイルスは、90%を超える純度を有することが判明し、in vivoでの使用に適していることがわかりました。
