まず、凍結したヒト脂肪由来間葉系幹細胞が入った2本の凍結保存チューブを、液体窒素から3番の継代で取り出します。完全に解凍されるまで、摂氏37度の水浴でそれらを攪拌します。次に、75%アルコールを使用してチューブを消毒します。
消毒したチューブを非常に清潔なテーブルの上に置きます。ピペットを使用して細胞懸濁液を吸引し、15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。250 G、摂氏4度の低速遠心分離機でチューブを5分間遠心分離します。
その間、10センチの培養皿を4つ用意し、各皿に9ミリリットルの培地を追加します。各皿に名前、細胞の種類、世代、実験日をマークします。次に、摂氏37度のサーモスタットセルインキュベーターで予熱します。
5分間の遠心分離が終了したら、遠心チューブを消毒してから、超清潔なテーブルに移します。ピペットを使用して上清を取り除き、4ミリリットルの培地を加えて、目的の細胞濃度を達成します。溶液が均一に分散するまで、溶液を穏やかに攪拌します。
次に、予熱した各皿に1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、水平な面で交差パターンで攪拌して振とうします。光学顕微鏡で40倍の倍率で細胞を観察してから、皿を摂氏37度のインキュベーターに入れます。2日目は、光学顕微鏡で40倍の倍率で細胞の状態を観察してから、交換培地の準備に進みます。
消毒後、培養皿をバイオセーフティレベル2の超清潔なテーブルに移します。各培養皿から培地を取り出します。2ミリリットルのPBS溶液で皿をやさしくすすぎ、各皿に10ミリリットルのミディアムを追加します。
上清を採取する準備ができるまで、細胞をインキュベーターに移します。
