脂肪由来間葉系幹細胞培養からの細胞外小胞(EV)の抽出

まず、細胞が80%コンフルエントになったら、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞培養物から上清を回収します。ピペットを使用して上清を慎重に収集し、50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。チューブを300 x gで室温で10分間遠心分離し、懸濁細胞を除去した後、ピペットを使用してペレットを乱さずに上清を回収します。

上清を2000 x gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。得られた上清をピペットで収集し、0.22ミクロンのメンブレンでろ過して、大きな粒子と細胞の破片を取り除きます。濾液を10, 000 x gで4°Cで30分間超遠心分離します。

次に、摂氏4度で70分間、100, 000 x gで最終遠心分離を行います。ピペットを使用して、ペレットを収集せずに上清を取り除きます。ペレットをPBSに再懸濁してから、チューブを100, 000 x gで摂氏4度で70分間遠心分離します。

上清を取り除き、得られた細胞外小胞またはEVのペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。最後に、EVサスペンションを1ミリリットルの遠心分離管に移し、さらなる分析まで摂氏4度で保管します。透過型電子顕微鏡では、EVが二重膜を持つカップ状の構造が明らかになりました。

ナノ粒子追跡分析により、粒子径分布は約50〜150ナノメートルであることが示されました。ウェスタンブロット解析により、EVの特徴的なマーカータンパク質がスムーズに発現していることが示されました。