まず、シスプラチン、金属標識抗体、インターカレーター-イリジウム溶液で染色した骨格筋細胞を取り出し、遠心分離により細胞をペレット化します。上清が除去されたら、渦巻いた細胞に1ミリリットルのCSMを追加します。遠心分離により細胞をペレット化し、1ミリリットルのCASバッファーで洗浄します。
遠心分離後、上清を約200マイクロリットルまで吸引します。ボルテックスされたサンプルに1ミリリットルのCASバッファーを追加し、細胞数のために5マイクロリットルを分注します。細胞を遠心分離し、上清を50マイクロリットルまで吸引した後、CASバッファー内の細胞を最終濃度1ミリリットルあたり100万細胞まで再懸濁し、キャリブレーションビーズを添加して最終濃度0.1倍を達成します。
サンプルをマスサイトメーターにロードして、毎秒400〜500細胞の流速でデータを収集し、収集後にデータを正規化します。必要に応じて、各サンプルの個々のフローサイトメトリー標準ファイルまたは FCS ファイルを 1 つのファイルに連結します。イリジウムインターカレーター陽性事象をゲーティングすることにより、単一細胞を同定します。
シスプラチンが陰性のイベントを選択して、生細胞のゲートに充てます。関心のある集団をゲートし、幹細胞と前駆細胞の相対的な比率を定量化します。高次元解析を実行するには、対象の母集団をエクスポートし、クラスタリング アルゴリズムを使用します。
Xシフト解析を行うには、VortexソフトウェアパッケージとJava 64ビットをダウンロードしてください。エクスポートした細胞母集団をローカルデータベースにアップロードし、クラスタリングパラメーターを定義します。X シフト クラスター内の細胞集団間の空間的関係を視覚化するには、力指向レイアウトを実行します。
CyTOF解析により、幹細胞、および前駆集団1から3の4つの集団の配列が同定されました。前駆細胞集団P1およびP2は、ますます成熟した前駆細胞に対応する。P3は以前に同定されましたが、その存在量が少ないため特徴付けられていませんでした。
損傷後の幹細胞および前駆細胞の動態を、CD9 by CD104 を用いて軸ドットプロットで解析した。幹細胞集団の顕著な増加が3日目に観察され、拡大を示唆しています。これは、細胞増殖を示すヨードデオキシウリジンの取り込みの増加と、カラーオーバーレイで示されるMyoD発現の増加によって裏付けられました。
CD98、CD44、MyoD、およびヨードデオキシウリジンを高レベルで示した活性化幹細胞が同定され、損傷後3日目の高増殖と活性化状態が強調されました。
