蛍光細菌取り込みアッセイを用いた新生児骨髄由来マクロファージの食作用機能の評価

まず、マウスの新生児骨髄由来マクロファージを、フェノールレッドや抗生物質を含まない完全なDMEMに再懸濁します。35ミリメートルの四角い皿の象限ごとの200, 000の密度で細胞懸濁液の500マイクロリットルを播種する。マイナス80°Cから大腸菌の事前計算されたストックを削除します。

所望の量の細胞懸濁液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに分注して、感染の多重度が25の場合に細菌接種物を調製し、次いでPBSを総容量1ミリリットルに添加する。細菌懸濁液を2000Gで5分間遠心分離し、ペレットを50マイクロリットルのPBSに再懸濁します。最終濃度500マイクロモルまで緑色蛍光pH感受性色素を添加し、暗所で20分間インキュベートして色素の結合を行います。

1ミリリットルのPBSで細菌を1000Gで5分間遠心分離することにより、細菌を4回洗浄します。ペレットをフェノールレッドを含まない500マイクロリットルの完全DMEMに再懸濁し、骨髄由来のマクロファージ培養物を添加します。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。

細胞透過性の赤色蛍光色素を200ナノグラム添加してリソソームを染色すると、細菌感染時に骨髄由来マクロファージ内に豊富な緑色蛍光細菌の食作用が検出されました。緑色の蛍光は、酸性化されたリソソームを示す赤色の蛍光でさらに局在します。食作用と緑色のpH感受性ジポジティブ新生児骨髄由来マクロファージの出現も、4時間の感染を通じて観察されました。