まず、免疫染色されたHCC切片の画像を取得します。QuPath 0.4.3をダウンロードして開きます。コンピュータ上のexeファイル。
QuPathプロジェクトを整理するための適切な名前で新しいフォルダーを作成します。ソフトウェアの左上隅にある[プロジェクトの作成]ボタンをクリックして、新しく作成したフォルダを選択します。次に、スキャンした画像をQuPathソフトウェアウィンドウにドラッグします。
新しいウィンドウが表示されたら、画像タイプの設定を選択してH-DABをクリックし、次にインポートをクリックします。インポートした画像を表示するには、メニューの左側のウィンドウのリストを確認し、画像をダブルクリックして開きます。メインメニューからファイルを選択し、画像をプロジェクトとして保存します。
メインメニューのブラシツールまたはワンドツールを選択して、腫瘍領域に注釈を付けます。腫瘍領域が不連続な場合は、各領域に個別に注釈を付けます。Control キーを押しながら、すべてのリージョンを選択します。
次に、右クリックして[複数編集]を選択し、[選択したものをマージ]を選択します。その後、メインメニューの[自動化]をクリックし、[スクリプトエディタの表示]を選択します。必要なスクリプトをコピーしてスクリプトエディタに貼り付け、[実行]をクリックします。
または、メインメニューからポリラインツールを選択して、悪性細胞の巣と隣接する非腫瘍組織を分離する境界線を正確に描画します。次に、メインメニューから境界線を選択し、オブジェクトを選択し、注釈をクリックして、注釈の展開を選択します。拡張半径を500マイクロメートルに設定し、ラインキャップにフラットを選択します。
remove interiorをアクティブにし、constrain to parentがアクティブになっていることを確認します。次に、新しく作成した注釈を右クリックします。[edit single] を選択し、[split] を選択します。
注釈付き領域に正しい名前を付けるには、左側のリストで注釈を右クリックします。[プロパティの設定] を選択し、内側と外側のマージン領域に適切な名前を入力します。残りの腫瘍領域を腫瘍の中心として定義します。
前に示したように、外側の縁に隣接する幅500マイクロメートルの腫瘍周囲領域を拡張します。詳細なピクセル分析を行うには、メインメニューから長方形ツールを選択します。次に、区別するすべてのピクセルタイプを含む領域に注釈を付けます。
次に、メインメニューに移動します。「分析」を選択し、「前処理」をクリックします。次に、[染色ベクトルの推定]をクリックします。
ビジュアルステインエディタをアクティブにしたら、自動を選択して[OK]をクリックします。推定された染色ベクトルをH-DABと命名します。ピクセル解析では、メインメニューの長方形ツールを使用して、ヘマトキシリンで染色された核の小さな部分を強調表示する方法もあります。
次に、左側のメニューにアクセスして画像を選択します。次に、ステイン1をダブルクリックし、[はい]を選択します。ここでも、長方形ツールを使用して小さな領域に注釈を付け、DABによる陽性染色を示します。
この後、左側のメニューから画像を選択し、染色2をダブルクリックしてから「はい」をクリックします。メインメニューから陽性免疫細胞の面積分率を評価するには、分類オプションをクリックし、ピクセル分類を選択して、しきい値の作成をクリックします。その後、解像度を高く設定し、DABチャンネルを選択して、シグマ0.5のガウスプレフィルターを適用します。
しきい値を 0.2 から 0.3 の間で調整します。しきい値を超えるピクセルを正のピクセルと定義し、しきい値を下回るピクセルを負のピクセルとして定義します。リージョンの選択には、任意のアノテーションを選択します。
分類子に名前を付けます。次に、[保存]、[測定]、[OK]をクリックします。結果を文書化するには、左側のメニューに表示されている結果をコピーして、スプレッドシートに転送します。
別の方法として、上部のメインメニューから測定を選択します。次に、[注釈の測定値を表示] を選択します。[クリップボードにコピー] を選択し、これらの結果をスプレッドシートに貼り付けて詳細なレコードを作成します。
最後に、画像を右クリックし、マルチビューに移動し、[ビューアを閉じる]をクリックして画像を閉じます。CD117タンパク質は、主に腫瘍間質および血管傍腔の丸みを帯びた細胞の細胞質膜で観察されました。CD117陽性細胞は、腫瘍嚢および外縁および傍腫瘍の血管傍領域でも観察された。
NKp46タンパク質は、主に正弦波様空間の丸みを帯びた細胞の細胞質膜、腫瘍中心の間質、および内側縁で観察されました。Nkp46陽性細胞は、腫瘍巣の周囲のカプセルおよび門脈路の外縁および腫瘍周囲領域の間質で観察されました。CD1aタンパク質は、主に丸みを帯びた細胞の細胞質膜に観察され、腫瘍中心および内縁領域の間質および正弦波様空間に散在または凝集体で観察されました。
CD1a陽性細胞は、傍腫瘍領域の正弦波および胆道上皮に見出された。
