まず、E3バッファーで麻酔をかけたゼブラフィッシュの胚を取得します。目的の蛍光を持つ胚を選択した後、明視野実体顕微鏡で心拍を視覚化します。幅広のチップトランスファーピペットを使用して、最大3つの胚を採取し、底面のガラスイメージングプレートに移します。
実体顕微鏡下で、ピペットを使用して、胚の周りの培地を1%低融点のアガロース溶液と交換します。ティーリング針に取り付けられたプラスチック製の細い先細りの先端を使用して、各胚をイメージングプレートの底にそっと押し込み、背側をガラスに向けます。胚を倒立共焦点顕微鏡にマウントします。
タイムラプス撮影パラメータを設定したら、画像を取得します。Imarisファイルコンバータソフトウェアを開き、ファイルを入力領域にドラッグアンドドロップします。[出力] メニューで、変換されたファイルの場所を指定します。
確認するために設定されたボクセルサイズをクリックし、 すべて開始 ボタンを押してIMS形式へのファイル変換を開始します。起動したら、解析ソフトウェアをアリーナで開始します。「フォルダを観察」をクリックして、以前に変換したファイルを開きます。
ファイルがソフトウェアにロードされたら、[Slice] ビューをクリックして z スタックをスクロールします。[スライス] ツールバーのスライダーを使用して、選択したセルの直径をポインターで描画した後、セルの直径を計測します。マウスをクリックしてドラッグし、セル コアにまたがるセグメントを描画し、ビュー領域の右側にあるメジャー ツールバーで描画されたセグメントの長さを確認します。
セルを自動的に検出するには、3Dビューに戻り、オブジェクトツールバーのスポットアイコンをクリックしてオブジェクトリストに新しいスポットオブジェクトを追加し、自動スポット作成ウィザードを開きます。ウィザードの最初のステップで、関心領域のみをセグメント化するオプションを使用します。次に、Track Spots Over Timeオプションを有効にしてトラッキングデータを計算し、Object-Object Statisticsを有効にしてスポット間の比較を可能にし、データの範囲を拡大します。
ウィザードウィンドウの右下にある[次へ]ボタンをクリックします。胚の視蓋を囲む関心領域、またはROI領域を指定します。その各面にある小さな白い矢印をクリックしてドラッグし、ROIのサイズを変更します。
次に、時間間隔を調整して記録されたすべてのフレームに拡張します。次に、ソースチャネルを選択し、以前に取得したセル直径の測定値を推定XY直径として設定します。[背景の減算]オプションを有効にし、[次へ]をクリックします。
強度のしきい値を下限しきい値と上限しきい値のボックスに直接入力して、すべてのセルを確実に検出します。View Areaをクリックすると、これらすべての変更をリアルタイムで観察できます。満足したら、[Next] をクリックして選択した品質しきい値を検証し、[View Area] をクリックして、これら 2 つのパラメータをソース チャネルに重ねて満たすスポットを視覚化します。
次に、トラッキングアルゴリズムとしてAutoaggressive Motionを選択し、多かれ少なかれ連続的なモーションを持つセルを追跡します。2 つのフレーム間のスポットの動きを観察して、セルが 2 つの時間ポイント間を移動する最長距離を判断し、[最大距離] フィールドに推定値を入力します。最大ギャップ サイズを設定するには、フレーム間の間隔が 60 秒未満の場合はサイズを 3 に使用し、時間間隔が長い場合は同じサイズを増やします。
検出されたすべてのオブジェクトでギャップを埋めるようにして、検出しきい値を下げ、トラックを接続します。次に、[次へ]をクリックすると、ソフトウェアが以前に生成されたすべてのスポットのトラックを自動的に生成します。取得したトラックが多数あるか断片化している場合は、[前へ]ボタンを使用して作成ウィザードに戻り、以前に定義した最大距離を調整します。
3 分から 8 分未満のトラックを除外するには、トラック継続時間フィルターの下限のデータ フィールドに値を直接入力します。[次へ] をクリックしてフィルターを確定し、作成ウィザードに進みます。皮膚マクロファージから生成されたトラックを解析から手動で削除し、脳実質ミクログリアに焦点を当てます。
トラックエディタを使用して、トラック内の他の潜在的な間違いを手動で修正します。表示領域の右側にある円の「Select Mode」ボタンをアクティブにして、変更や調整が必要なトラックをハイライトします。問題のあるトラックを選択したら、[Connect]ボタンと[Disconnect]ボタンを使用して、セルの動きを正しく表すように編集します。
トラックエディタで[Circle Select Mode]を選択し、重複した単一のスポットを削除します。ミクログリアレポーターを他の蛍光標識実質細胞と併用する場合は、新しい細胞集団までの推定XY直径と最大距離を調整します。画像へのソースチャネル入力を変更します。
最後に、「統計」タブを使用して、目的の追跡統計を抽出します。[設定]ボタンをクリックし、以前に作成した各スポットオブジェクトまたはサーフェスオブジェクトの計算の統計を選択します。ゼブラフィッシュの胚の脳全体を画像化し、ミクログリアに対するニューロンの位置を可視化しました。
このプロトコルを使用して得られた空間データは、ミクログリア細胞の平均速度、1時間でカバーする平均距離、平均二乗変位、および異なる時間における空間内の分布を示しています。
