Monochamus alternatus由来の真菌性病原体の単離と行動同定

マツノコギリ、Monochamus alternatus beetlesを収集した後、新鮮な小枝を含む滅菌チューブにカブトムシを入れます。カブトムシを摂氏25度の非加湿インキュベーターで飼育します。孵化後、摂食と移動性の低下を示すカブトムシを記録します。

硬い死んだカブトムシを濡れたチャンバーに移します。真菌感染症にかかったカブトムシを、触角、頭、胸部、腹部、翼、脚などの主要な位置に解剖します。はさみを使用して、各位置の外皮を細かく切ります。

これらのピースの外面を抗生物質を含むPDAプレートにそっと押し付けます。プレートをパラフィルムで密封し、組織が菌糸体で完全に覆われるまで摂氏25度でインキュベートします。次に、表現型特性に従って単一のコロニーを新しいPDAプレートに移します。

真菌ゲノムDNA単離キットを使用してゲノムDNAを抽出します。プライマーITS1およびITS4を含むPCR混合物を調製して、DNAのrDNA-ITS領域を増幅します。カメラを使用して、PDAプレートの表側と裏側で成熟した真菌の純粋なコロニー形態をキャプチャします。

純粋な真菌のコロニーから分生子を接種針で摘み取り、滅菌水を一滴加えたスライドガラスに移します。次に、気泡を入れずに試料にカバースリップを置きます。真菌コロニーの端からメスで5ミリメートルの寒天ブロックを切り取り、滅菌水を一滴加えたきれいなスライドガラスに移します。

細い針を使用して、真菌を寒天から慎重に分離し、特定の構造を観察します。光学顕微鏡下で、菌糸、分生子、フィアリド、分生子の姿勢など、真菌の無性形態を観察します。