まず、24時間飢餓状態にあるMonochamus alternatusとTribolium castaneumのカブトムシの表面を漂白剤、エタノール、蒸留水で滅菌します。真菌感染を誘発するには、まず、松の小枝または小麦ふすまを分生子懸濁液に10秒間浸します。次に、カブトムシを分生子懸濁液に浸します。
乾燥後、カブトムシ1本と小枝1本を滅菌済みの50ミリリットルチューブに入れます。カブトムシを摂氏25度の非加湿インキュベーターで飼育します。インキュベーション後、死んだカブトムシを新しい50ミリリットルのチューブに移し、チューブ内に滅菌した湿った綿を入れます。
真菌感染症に感染したカブトムシの体を、アンテナ、頭、胸部、腹部、翼、脚などの位置に解剖します。成熟した真菌コロニーの5ミリメートルディスクプラグを切断します。感染したカブトムシ組織を、摂氏4度で予め冷やした2.5%グルタルアルデヒドに2日間入れます。
次に、サンプルを0.1%リン酸緩衝液で5分間3回洗浄し、エタノール濃度を上げてそれぞれ10分間脱水します。真空凍結乾燥機で試料を乾燥させた後、走査型電子顕微鏡で真菌の構造を観察します。小麦ふすまを針生子懸濁液で10秒間処理し、乾燥後、ペトリ皿に移します。
T.castaneum カブトムシを分生子懸濁液に10秒間浸してから、小麦ふすまの入ったシャーレに入れます。インキュベーション後、プレートから死んだカブトムシを数えます。真菌ゲノムDNA単離キットを使用して、寄生性昆虫病原性真菌のゲノムDNAを抽出します。
所定のプライマーセットを使用して、遺伝子特異的増幅のためのPCR反応混合物を調製します。シーケンシング後、ClustalX 2を使用してヌクレオチド配列をアラインメントします。最後に、最尤法に基づくMEGA6を用いて系統解析を行います。
Aspergillus austwickii、Akanthomyces attenuatus、Scopulariopsis alboflavescensなどの寄生菌は、M.alternatusに重大な感染症状を引き起こしました。SEM観察は、カブトムシの表面にあるこれらの寄生菌の形態学的特性をさらに支持しました。昆虫病原性活性は、対照群と比較して寄生菌の死亡率が有意に高いことを示しました。
この多遺伝子系統樹は、3つの寄生菌種とそれぞれの属内の他の種との間に遺伝的距離があることを示した。
