pHプロファイリング用に事前に調製したヒト胃オルガノイドを入手します。まず、参照電極をコネクタを介してpH電極ケーブルに接続します。次に、微小電極をアンプに接続し、アンプをソフトウェアで接地されたPCにUSBケーブルで接続します。
微小電極と参照電極を脱イオン水に入れ、両方の先端を液体に少なくとも1cm浸します。50ミリリットルのコニカルチューブに、必要なキャリブレーションバッファーを充填します。繊細なラボ用ワイプを使用して、保護チューブと参照電極を静かに拭き取ります。
ソフトウェアを開いた後、[キャリブレーション]タブで[Yズーム]ボックスを選択し、センサー信号の読み取り値をミリボルトに設定します。pH 4.01 バッファーの電極から始めて、既知の pH 値として 4.01 を入力します。ミリボルトの読み取り値が安定したら[ポイントの追加]を選択し、両方の電極を脱イオン水に戻してすすぎます。
pH 9.21 バッファーに対してこのプロセスを繰り返した後、信号が約 83 ミリボルトで安定しているときに [ポイントの追加] をクリックします。微小電極がpH 4.01と9.21の間で2点の検量線で直線的に応答することを確認します。保護ケースをベンチに慎重に平らに置き、すばやくすばやくケースを引き抜いて微小電極を取り外します。
マイクロマニピュレータに微小電極を装着し、ステレオスコープとマイクロマニピュレータを配置して、微小電極が培養皿に向かって自在に前進できるようにします。オルガノイドを含む培養皿をプロファイリングのために配置します。参照電極をclに固定しますamp ステレオスコープの左側にあるリングスタンドの。
微小電極の先端が媒体に十分に沈むまで、微小電極の先端を視覚的に進めます。信号が安定したら、メディアのpH測定値を3回記録します。次に、オルガノイドに触れることなく、微小電極をゆっくりとECMに進めます。
平均を計算するために、少なくとも3つのpH測定値を記録します。微小電極をオルガノイド表面の垂直軸に沿って配置し、基底外側オルガノイド表面を貫通せずにわずかにくぼみを作ります。微小電極をオルガノイドに慎重に進め、管腔のpHを測定します。
完了したら、次のオルガノイドのpH測定に進みます。清掃する電極を保護チューブに戻します。電極を脱イオン水、エタノール、およびバッファーで順次洗浄します。
参照電極を3モルの塩化カリウム溶液で満たされたビーカーに入れます。2マイクロリットルのガラスキャピラリーに滅菌鉱物油を埋め戻し、マイクロマニピュレーター制御のナノリットルオートインジェクターにロードします。最後に、0.02%のメチルレッドと150ミリモルの塩酸を含む溶液で満たし、9.2ナノリットルの溶液で注射を行います。
同じ培養プレート上の10種類のオルガノイドにおける管腔pHの変動は最小限で、測定値は一貫して約8.16でした。5つの異なるオルガノイド系統の管腔内pHは各培養内で一貫していましたが、オルガノイド系統間では有意なばらつきが観察されました。オルガノイド管腔のpHは一貫してECMよりも低く、ECMは培地のpHよりも低かったことから、管腔のpHは生理学的に関連性があり、周囲の培養環境によってのみ決定されるわけではないことが示唆されています。
オルガノイド内腔にメチルレッドを注入すると、pHが6.2を超えることが確認され、中性に近いpHを示した微小電極測定値と一致しました。
