まず、予熱したイメージング培地と滅菌顕微鏡ディッシュを、コーティングされたまたはコーティングされていないカバーガラス表面を備えた作業プラットフォームに置きます。アガロース型を囲む培地を取り除いた後、型の内容物を190マイクロリットルの培地に慎重に再懸濁してから、浮遊するスフェロイドを2ミリリットルのバイアルに移します。低付着プレートのスフェロイドの場合は、スフェロイドを個々のウェルからバイアルに1つずつ移します。
スフェロイドがバイアルの底に5分間沈殿し、目に見えるペレットが形成されます。スフェロイドをそのままにしてバイアルから培地を取り出し、十分な量の新鮮なMcCoy's 5A培地に静かに再懸濁します。次に、顕微鏡ディッシュのウェルごとに等量のスフェロイド懸濁液を移します。
スフェロイドを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。既知量のスフェロイド懸濁液に蛍光プローブを添加し、摂氏37度で1時間インキュベーションを続けます。インキュベーション後、蛍光プローブを含む培地を必要な量のイメージング培地と交換します。
顕微鏡制御ソフトウェアを起動し、ステージキャリブレーションを初期化します。次に、必要な目標を選択します。[Open project window] を選択し、[Create a New Project] をクリックします。
次に、新しく作成したプロジェクトを右クリックし、ドロップダウンメニューで[名前の変更]オプションを選択します。研究プロジェクトファイルに標準名を付けます。「Acquisition」ウィンドウを開きます。
パルス白色光レーザー励起波長と、ハイブリッドまたは共振走査検出器の必要な範囲を設定します。次に、スキャンのラインタイプまたはフレームタイプを選択します。[Acquisition]ウィンドウで、[FLIM]モードを選択して、フォトンカウンティングと組み合わせたイメージングを実行します。
次に、白色光レーザーパルスの繰り返し率を選択します。Fast Liveモードを使用してプレビューイメージングを開始し、関心のあるセクションにイメージングオブジェクトのファインフォーカスを調整します。ピクセル強度ヒストグラムを見て、適切なレーザー強度ピンホールのサイズと解像度を調整します。
Fast Liveでは、座標とスキャン方向を設定し、それらをZ-Stackウィンドウで開始および終了するように属性を設定します。Z ステップのサイズまたはステップ数を選択します。必要な設定をすべて適用したら、イメージングを開始します。
画像に適切な名前を付けて、イメージングプロジェクトを保存します。形成方法が異なれば、スフェロイドのサイズも異なります。低付着プレート中のHCT116スフェロイドは、ハイスループット法と比較して、5日後に有意に大きかった。
低接着法により、ヨウ化プロピジウム染色によって検出される壊死性コアが明らかに発生しました。対照的に、他の方法で作製したスフェロイドは、死細胞がスフェロイド体全体に拡散して分布していることを示しました。異なる方法で作製したHCT116スフェロイドの酸素化は、Sphericalplate 5Dよりもマイクロ組織と実験室で作られたマイクロモールドでより多くの酸素化されたスフェロイドを示しました。
Sphericalplate 5Dスフェロイドのスフェロイド酸素化は、マイクロティッシュや実験室で作られたマイクロモールドと比較して、酸素化が低いことを示しました。低付着プレートを用いて作製したHCT116スフェーザ解析により、2光子NADPH-FLIMによる解糖コアと非解糖コアの存在が明らかになりました。
