レンチウイルス形質導入による低酸素応答性CAR-T細胞の開発

まず、凍結保存されたヒト末梢血単核細胞のバイアルを摂氏37度の水浴に入れます。解凍したら、PBMC懸濁液を9ミリリットルのTGMを含む15ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液のアリコートをピペッティングしてカウントした後、チューブを300 Gで5分間遠心分離します。

ペレット化したPBMCを3ミリリットルのTGMに再懸濁します。次に、必要な量の細胞懸濁液を6ウェルプレートに移します。細胞蘇生の前日に、100マイクロリットルのマウス免疫グロブリンG磁気ビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

チューブに1ミリリットルのPBSを加え、磁気スタンドに置いてビーズを洗います。ビーズを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次に、抗体を懸濁液に加えます。

ピペットを使用して、懸濁液を穏やかによく混ぜます。サスペンションを摂氏4度のロッカーに一晩置きます。前述のようにビーズをPBSで洗浄した後、100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。

次に、NHCD3 hCD28コーティング免疫ビーズをプレートに添加し、インキュベートします。48時間のインキュベーション後、細胞懸濁液を混合し、15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。チューブを磁気スタンドに3分間置きます。

次に、上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。300マイクロリットルのTGM中の5つのPBMCの累乗に10の5倍を播種し、48ウェルフラットプレートのウェルに入れます。200マイクロリットルのレンチウイルスストックを対応するウェルにピペットで移します。

次に、遠心分離する前に、硫酸プロタミンを最終濃度10マイクログラム/ミリリットルまで加えます。各ウェルから300マイクロリットルの上清をピペットで取り出し、次に各ウェルに1ミリリットルの新鮮なTGMを追加します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%未満の加湿インキュベーターに入れます。

2〜3日ごとに新鮮な0.5〜2ミリリットルのTGMをプレートに加えます。次に、細胞を12ウェルプレートに移し、続いて6ウェルプレートに移し、総細胞密度が4ミリリットルの容量で600万に達するまで移します。