低酸素感受性CAR-T細胞による細胞毒性のin vitro評価

まず、200マイクロリットルのFBSDMEMを含む2つの平底96ウェル組織培養プレートの各ウェルに1000個の標的細胞を播種します。翌日、各ウェルの上部から100マイクロリットルの上清を慎重にピペットで取り出します。キメラ抗原受容体T細胞または非形質導入T細胞を100マイクロリットルのFBSDMEMに異なる比率で添加します。

1つのプレートを21%酸素雰囲気に入れ、もう1つのプレートを1%酸素雰囲気の移動式二酸化炭素酸素窒素インキュベーターチャンバーに入れます。24時間の共培養後、ピペットを使用して、すべての上清を新しいU底96ウェルプレートに慎重に移します。サイトカイン検出のために、上清を摂氏マイナス20度で保存します。

次に、60マイクロリットルのパッシブ溶解バッファーを、黒色の平底96ウェルプレートの各実験ウェルに加えます。プレートをシェーカーに30分間置くと、効率的な細胞溶解が得られます。各実験ウェルに60マイクロリットルのホタルルシフェラーゼ基質を追加します。

マイクロプレートリーダーを使用して、ルシフェラーゼ活性をすぐに測定します。最後に、与えられた式で正規化された細胞毒性率を計算します。CARを標的とする低酸素感受性HER2は、雰囲気が低酸素か正常酸素かに関係なく、標的細胞を効果的に殺すことができました。

対照的に、HER2-BBz-ODD CAR T細胞は、すべての条件で正常酸素条件下で有意に弱い細胞毒性を示しました。