まず、100ミリメートルのシャーレに10ミリリットルの完全増殖培地に6MCA205線維肉腫細胞の3倍10をプレートします。細胞に紫外線を照射し、摂氏37度で5%二酸化炭素と少なくとも6時間インキュベートして細胞を死滅させます。in vitroで分化した樹状細胞(DC)を1100Gで2回、完全増殖培地中で4分間洗浄します。
トリパンブルー色素排除試験を使用して、骨髄由来の空のDCを数えます。照射したがん細胞を1100Gで5分間遠心分離します。エンプティDCと照射アポトーシス細胞の共培養を、12ウェルプレートで2対1の比率で、摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間設定します。
翌日、15ミリリットルチューブ内の10ミリリットルの完全増殖培地で、細胞を1100Gで5分間2回洗浄します。細胞表面染色のために、骨髄由来のDCを20マイクロリットルの冷FACSバッファーに再懸濁し、暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。細胞をFACS緩衝液で洗浄した後、活力固定可能な近赤外色素を含むPBS100マイクロリットルを30分間加えます。
細胞をPBSで一度洗浄してから、FACSバッファーに再懸濁します。FSCAおよびSSCAの特性に基づいて目的の細胞を同定します。次に、FSCAとFSCHをプロットして、細胞のダブレットと凝集物を分析から除外します。
780〜60ナノメートルの発光バンドパスフィルター領域とSSCAをプロットして、死細胞を除去します。575 から 26 および 530 から 30 ナノメートルの発光バンドパスフィルターを使用して、CD11C マーカーと PKH67 蛍光細胞リンカーの細胞陽性を 2 つのパラメータ密度プロットで検出します。計数後、アポトーシスMCA205細胞を取り込んだ骨髄由来DCとCD8 T細胞を、摂氏37度、二酸化炭素5%で2対5対1の比率で72時間培養します。
EdUを最終濃度10マイクロモルで共培養培地に加え、16〜20時間インキュベートします。CD8クロスプライムを1100Gで2回5分間遠心分離し、冷FACSバッファーで表面マーカーを4°Cで20分間暗所で染色します。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した後、活力固定型水染料を含むPBS100マイクロリットルに細胞を30分間再懸濁します。
細胞懸濁液をフローチューブ内のPBS中の1%BSA3ミリリットルで1回洗浄します。細胞固定のために100マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを15分間加えます。細胞を100マイクロリットルのサポニンベースの透過処理でインキュベートし、試薬を15分間洗浄します。
500マイクロリットルの反応カクテルを加え、暗闇で30分間インキュベートします。洗浄後、細胞を100マイクロリットルのサポニンベースの透過化および洗浄試薬に再懸濁します。FSEAおよびSSEAの特性に基づいて目的の細胞を同定します。
次に、FSEAとFSEHをプロットして、細胞のダブレットと凝集物を分析から除外します。525〜50ナノメートルの発光バンドパスフィルター領域とSSCAをプロットして、死細胞を除去します。530〜30ナノメートルおよび575〜26ナノメートルの発光バンドパスフィルター密度プロットを使用して、CD8aおよびCD3に対する細胞の陽性性を検出します。
660〜620ナノメートルのバンドパス蛍光フィルターを使用して、Alexa Fluor 647 EdUの取り込みについて細胞を単一パラメーターヒストグラムで解析します。CD11c陽性樹状細胞は、摂氏37度でアポトーシスMCA205がん細胞を効果的に飲み込み、初期のがん免疫サイクル段階で温度依存的な食作用を示しました。食作用後、樹状細胞はCD86およびMHC-IIのレベルの増加とPDL1のレベルの低下を示しました。
成熟樹状細胞によって活性化されたCD8陽性T細胞のクローン増殖は、約20%の増殖率で明らかでした。腫瘍オンチップモデルを使用して、がん細胞から放出されたアラーチンに対するこれらのT細胞の走化性応答が観察されました。
