共培養からクロスプライミングしたCD8を回収した後、10ミリリットルの完全増殖培地中で1100gで10分間遠心分離します。100 μLの死細胞除去マイクロビーズに1 x 10を合計7細胞の電力で再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。分離カラムをマグネティックセパレーターに置き、結合バッファーですすいでください。
細胞懸濁液を分離カラムに移し、フロースルーを回収します。カラムを洗浄した後、通過する標識されていない細胞を回収し、以前に採取したフロースルーと結合します。濃縮した生CD8を1100 gで5分間クロスプライミングした完全増殖培地で遠心分離します。
カウント後、クロスプライミングしたCD8細胞を新鮮なMCA205細胞と12ウェルプレートで2対1の比率で培養し、摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。CD8エフェクターを回収する前に、モネンシンとブレフェルジンをがん免疫細胞共培養に6時間加えます。その後、CD8エフェクターを回収し、1100gで5分間2回遠心分離します。
冷たいFACSバッファーで調製した3つの異なる一次抗体ミックスに細胞を再懸濁し、光から保護するために摂氏4度で20分間インキュベートします。Mix Cから100マイクロリットルの固定液を細胞口蓋に加え、暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。細胞を冷洗浄バッファーに再懸濁し、摂氏4度で30分間インキュベートします。
FACSバッファーで細胞を2回洗浄した後、Vitality Fixable Aqua Dyeを含むPBS100マイクロリットルを細胞ペレットに30分間加えます。FSCAおよびSSCAの特性に基づいて目的の細胞を同定します。次に、FSCAとFSCHをプロットして、細胞のダブレットと凝集物を分析から除外します。
525/50ナノメートル発光バンドパスフィルターとSSCAをプロットして死細胞を除去し、660/20および780/60ナノメートル発光バンドパスフィルターを使用して、CDAAとCD3の細胞陽性を2つのパラメータ密度プロットで検出します。さらに、CD137マーカーについてはCD44、CD25、CD69マーカーについて、ミックスA、B、Cについてはインターフェロンガンマ陽性およびグランザイムBについて、それぞれ細胞を分析します。腫瘍死滅アッセイでは、共培養培地にリアルタイムの細胞死定量色素を添加します。
生細胞解析システムでプレートを摂氏37度に温めた後、2時間ごとに最大72時間データスキャンを実行します。細胞を1000gで5分間2回遠心分離します。表面マーカーの細胞を20マイクロリットルの冷FACSバッファーで染色し、暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。
次に、バイタリティ色素であるヨウ化プロピジウムを添加して細胞を染色し、ゲーティング戦略を行います。FSCAおよびSSCAの特性に基づいて目的の細胞を同定します。次に、FSCAとFSCHをプロットして、細胞のダブレットと凝集物を分析から除外します。
450/50ナノメートルの発光バンドパスフィルターを使用して、CD45陰性のがん細胞を検出します。単一パラメータヒストグラムで、610/620ナノメートルのバンドパス発光フィルターを使用して、平均蛍光強度としてヨウ化プロピジウムの取り込みについて細胞を分析します。マルチパラメータフローサイトメトリーにより、早期活性化マーカーCD69、後期活性化マーカーCD44およびCD25、CD137の膜発現、およびCD107、腫瘍反応性マーカーの表面発現レベルを増強した。
細胞傷害性分子、グランザイムB、およびインターフェロンγ陽性の細胞内レベルは漸進的かつ有意に増加し、共培養の72時間で発現のピークに達しました。同族共培養されたMCA205細胞は、有意なレベルのCD8エフェクター媒介死を受けました。
