まず、Hank's Balanced Salt Solutionに10ミリモルのヒープバッファーを添加して、洗浄バッファーを調製します。使用するまで、バッファーを摂氏4度で保管してください。DMEMで網膜色素上皮またはRPE培地を調製し、水浴で摂氏37度に予温します。
安楽死させたマウスを横向きに平らに置き、目を上に向けます。人差し指を目の上、親指を目の下に置きます。目の周りの骨構造にやさしく圧力をかけて、眼球を突き出させます。
少し開いたハサミの先を目の下に差し込み、目が眼窩から離れるまで手首を目から離すようにゆっくりと90度回転させます。すぐに70%エタノールに目を5秒間入れて転がします。次に、氷上に保持された洗浄バッファーに眼球を移します。
解剖顕微鏡下で、洗浄バッファーと浸したガーゼのストリップで満たされたペトリ皿に眼を置きます。ピンセットで視神経を保持し、外科用ナイフを使用して、オラセラータのレベルで穏やかに切開することにより、目を安定させます。Vannas Scissorsを切開部に挿入し、前部と硝子体が除去されるまでOra Serrataの周囲を切り取ります。
RPE層を乱さずに、テザー鉗子を使用してアイカップから網膜をそっと剥がします。はさみの助けを借りて、アイカップに穴を開けずにアイカップから視神経と余分な結合組織を取り除きます。アイカップを、1ミリリットルの0.25%トリプシンと0.02%EDTAが入った1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
アイカップを摂氏37度の水浴中で10分間インキュベートします。2分ごとにチューブを取り外し、底をカウンタートップに40回しっかりとたたきます。インキュベーション後、AP-1000ピペットを使用して3回穏やかに混ぜ合わせ、アイカップを乱します。
トリプシンを中和するには、アイカップを除いて、15ミリリットルの円錐管内の0.5ミリリットルのFBSに、切り離したRPEシートをすぐに重ねます。次に、滴下して、トリプシンを希釈するためにFBSおよびRPEシートの層にRPE培地を追加します。RPEを340Gで3分間遠心分離します。
上清を捨て、24ウェルプレートの適量のRPE培地に細胞を再懸濁します。RPEを摂氏37度で5%二酸化炭素と3日間インキュベートします。RPE単離の24時間後、核色素沈着細胞は完全な接着なしに沈降し始めます。
48時間から72時間にわたって、これらの細胞は付着して広がり、透明な核に暗い色素沈着を保持します。5日後、RPE細胞は、六角形の構造を持つ分極した単層に形成される細胞間接触の形成を開始する際の共流暢さの増加を示します。単離されたRPEは、RPE特異的マーカーと培養6日後のタイトジャンクションの完全性によって証明されるように、純度を示しました。
