まず、滅菌HBSSを含む100ミリメートルガラスプレートで新鮮なヒト心房サンプルを洗浄します。プレート内のサンプルを静かに振って、残留血液を取り除きます。少量のHBSSで湿らせた100mmプレートにサンプルを移します。
交差したメスで、サンプルを2ミリメートルサイズの立方体に切り刻みます。次に、4つの小さな心筋片を35ミリメートルプレートに移します。滅菌カバーガラスを破片の上に置き、穏やかな圧力をかけます。
1.5ミリリットルのDMEMをプレートにピペットで挿入します。次に、培養プレートを摂氏37度で、5%の二酸化炭素補給の下でインキュベートします。培養物が85%のコンフルエントに達したら、インキュベーターからプレートを取り外し、滅菌鉗子を使用してカバーガラスを持ち上げます。
次に、新しい35mmプレートに逆さまに置きます。次に、滅菌PBSを追加してすすぎます。次に、心筋の断片を取り除きます。
次に、DMEMをプレートからピペットで取り出します。滅菌PBSを使用して、成長した細胞を含むプレートをすすぎます。リンスを捨てた後、各プレートに0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルを追加し、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素と5分間インキュベートします。
インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡を使用して細胞の剥離を確認します。次に、トリプシン化をブロックするために、各プレートに2ミリリットルのトリプシン停止溶液(TSS)を追加します。細胞懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。
400Gで4°C、5分間遠心分離します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して上清を吸引します。次に、ペレットに3ミリリットルのDMEMを追加し、再懸濁します。
細胞懸濁液を60mmプレートに置きます。細胞を摂氏37度で、5%の二酸化炭素補給下でインキュベートします。次に、滅菌0.2%ゼラチン溶液の3ミリリットルを各60ミリメートルプレートにピペットで移します。
インキュベーション後、溶液を吸引し、さらに使用するまで3ミリリットルの滅菌PBSを加えます。心臓線維芽細胞を含むプレートをインキュベーターから取り出します。DMEMをプレートから取り出し、滅菌PBSですすいでください。
すすぎ液を捨てた後、各プレートに0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルを追加します。.顕微鏡を使用して、細胞の剥離を確認します。次に、各プレートに2ミリリットルのTSSを追加して、トリプシン化をブロックします。
細胞懸濁液を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。400Gで4°C、5分間遠心分離します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して上清を吸引します。
次に、ペレットに3ミリリットルのDMEMを追加し、再懸濁します。60ミリメートルのゼラチンコーティングプレートからPBSを取り出し、細胞懸濁液をプレートに入れます。線維芽細胞を合流状態で最大21日間培養します。
21日間の培養後、培地を吸引します。次に、プレートを3ミリリットルのPBSですすいでください。PBSを吸引し、1ミリリットルの脱細胞化溶液を加えた後、倒立造影顕微鏡でプレートを観察します。
2分後、4ミリリットルのPBSを静かにピペットで移し、プレート内の脱細胞化溶液を希釈します。希釈した溶液を吸引します。次に、プレートをPBSでやさしくすすいでください。
最後に、プレートに1ミリリットルのPBSを追加します。細胞外マトリックスコーティングプレートは、さらに使用するまで摂氏4度で保管してください。培養中に置かれた天然心筋の小さな断片からの線維芽細胞の増殖は、3〜5日以内に観察されました。
脱細胞化により、プレート表面に細胞外マトリックスコーティングが生じました。in vitroで産生された心臓細胞外マトリックスの組成と構造は、脱細胞化により保存されました。
