機械的間質血管画分(mSVF)脂肪吸引物からの単離および臨床応用のためのそのフィブリンハイドロゲル産生

まず、細胞培養フードで、回収した脂肪吸引液を50ミリリットルの遠心チューブに加えます。脂肪吸引液を滅菌済みの20ミリリットルルアーロックシリンジに移します。.次に、1.4mmコネクタをシリンジに取り付けます。

次に、2つ目の20ミリリットルルアーロックシリンジをコネクタの反対側に取り付けます。脂肪組織を一方のシリンジからもう一方のシリンジに約30回押します。次に、乳化した脂肪を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

脂肪を500Gで10分間遠心分離します。次に、油性の最上層を捨てます。分離した間質血管層を含む中央の精製層を収集し、それを新しい50ミリリットルの遠心分離管に移します。

次に、遠心分離チューブに40ミリリットルのマークまで補充されたDMEMを充填します。チューブを再度500Gで5分間遠心分離します。得られたmSVF層を回収し、新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに、単離された間質血管画分100マイクロリットルをピペットで挟みます。これに、10マイクロリットルのトロンビンを追加し、次に10マイクロリットルの塩化カルシウムをピペットで取り付けます。最後に、70マイクロリットルのトラネキサム酸を混合物に加えます。

新しいピペットチップを使用して、塗布の直前に10マイクロリットルのフィブリノーゲンをチューブに加えます。mSVFハイドロゲル混合物の重合後、分析目的で200マイクロリットルのハイドロゲルを12ウェルプレートにピペットで移します。次に、100マイクロリットルのフィブリンヒドロゲルをネガティブコントロールとして1つのウェルに加えます。

12ウェルプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素の下で30分間インキュベートします。次に、各ウェルに1ミリリットルの予熱した培地を追加します。12ウェルプレートを再びインキュベーターに戻し、4時間待ちます。

各ウェルに1ミリリットルのレサズリンを加えてから、再度24時間インキュベートします。レサズリンサンプルを96ウェルプレートにピペットで移します。翌日、細胞イメージングマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、最初の蛍光強度を測定します。

1日目、3日目、7日目の組織学的解析のために、フィブリンハイドロゲルを0.5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドでインキュベートします。次に、プレートに1%PBSを加え、摂氏4度で保存します。レサズリンアッセイは、血管画分およびヒドロゲルのin vitro細胞生存率を定量するために実施されました。

血管画分は3日目に生存率の低下を示しましたが、mSVF-フィブリンハイドロゲルの組み合わせはベースラインに近いままでした。7日目までに、mSVFの生存率は低下しましたが、mSVFとフィブリンハイドロゲルの組み合わせは増加しました。組織学的解析では、3日目と7日目に細胞核の数の減少は示されませんでした。

フィブリンハイドロゲルは、可視細胞クラスターが均一に分布し、最小限の分解を示しました。