まず、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、組織抽出したDNAの所望の領域を増幅します。シーケンシング増幅酵素マスターミックス、バッファー、および再蒸留水を室温に戻して、すぐにスピンオフします。シーケンシング用のチューブを準備した後、PCRチューブをプリセットPCR装置に置き、増幅します。
その後、PCR装置から製品を取り出し、反応生成物を光から保護された冷蔵庫に保管します。磁気ビーズを徹底的にボルテックスします。10マイクロリットルの磁気ビーズと40マイクロリットルの80%エタノールを96ウェルプレートに加え、プレートをフィルムで密封します。
96ウェルプレートをボルテックスシェーカーに10秒間置き、ビーズを完全に懸濁して混合します。次に、プレートを水平発振器に輪ゴムで固定し、最大設定で3〜5分間振動させます。次に、PCRプレートを磁気スタンドに置き、しっかりと押されていることを確認します。
スタンドを摂氏4度に3分間保ち、静電気吸着を行います。ビーズが吸着したら、天井フィルムをはがし、廃液を注ぎます。ビーズを40マイクロリットルの80%エタノールで2回すすぎます。
廃液を流し出した後、プレートを吸収紙の上に置き、軽くたたいて乾かします。磁気プレート付きの吸収紙を遠心分離機に入れ、120gで短時間回転させます。アルコールを取り除いた後、プレートを摂氏60度のオーブンに3〜5分間入れて、ビーズを完全に乾かします。
次に、プレートに40マイクロリットルの純水を加え、フィルムで密封します。ボルテックスシェーカーで3〜5秒間振って、プレートを水平シェーカーに置きます。それを固定し、プレートを3〜5分間振とうして、精製されたシーケンシング産物を溶解します。
最後に、溶解したシーケンシング産物を180 gで遠心し、キャピラリー電気泳動を用いたゲノム解析に使用します。この方法は、上流および下流のプライマーの増幅間隔で既知のRHOA G17V変異およびその他の低周波変異を検出できます。さらに、IDH2とJAK1という2つの遺伝子の変異も、この方法を用いて正しく解析されました。
