神経膠腫腫瘍微小環境を再現するための組織培養インサートにおけるヒアルロン酸コラーゲンハイドロゲルの調製

まず、コラーゲン、水酸化ナトリウム、滅菌超純水、PBS10倍、マイクロ遠心チューブ1本、メタクリル化ヒアルロン酸、光開始剤を氷の上に置きます。次に、組織培養インサートをプレートにセットし、ラベルを付けます。1ミリリットルあたり3ミリグラムのコラーゲン溶液を調製するには、高濃度コラーゲン、1つの正常水酸化ナトリウム、超純水、および10倍のPBSを組み合わせます。

マイクロ遠心チューブに部品を追加し、混合するときはピペットチップを水に浸したままにして、気泡の形成を防ぎます。その後、細胞を200Gで室温で5分間遠心分離します。次に、各細胞条件溶液の上部から余分な培地を静かに取り除き、その状態に必要な培地の量を残します。

これらの溶液を氷の上に置きます。各細胞条件溶液に、計算された量のコラーゲン溶液を添加します。次に、計算された容量の1%メタクリル化ヒアルロン酸を加え、続いて各細胞条件溶液に1ミリグラム/ミリリットルのLAPを加えます。

気泡の形成を避けるためにピペットチップを水に浸したまま、各コンディションチューブを一度に1つずつ混合し、各組織培養インサートに100〜150マイクロリットルを追加します。次に、385ナノメートルの紫外線ランプを定電流で点灯させます。各ゲルをフォトクロスリンクするには、各ウェルを一度に1つずつ45秒間紫外線にさらします。

次に、プレートを摂氏37度に30〜45分間置き、コラーゲンを架橋します。0.5%と2体積、およびビタミンAを含まないB27の体積1%のアストラル基底培地を使用して、液体圧力ヘッドをゲルに適用します。ウェルプレートと組織培養インサートに培地を添加して、ネットゼロフローを実現します。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%に少なくとも18時間または最大5日間置きます。