ヒトアデノシンデアミナーゼ1の血清安定性をテストするための吸光度ベースのマイクロプレート分析

まず、血清と酵素の混合物を、それぞれのコントロールとともに調製します。マイクロプレートリーダーで、260ナノメートルの吸光度を測定するためのキネティックリードプロトコルを設定し、最短の読み取り間隔を30分とします。次に、凍結したサンプルをすべて氷上で解凍し、解凍した各サンプルを、LoBind微量遠心チューブで摂氏37度に予熱した1x PBSで1〜10に希釈します。

5ミリモルのアデノシンストックを調製するには、50ミリリットルの1x PBSに66.8ミリグラムのアデノシンを加えます。250マイクロモル溶液に希釈した後、インキュベーターでアデノシンを摂氏37度に予熱します。96ウェル紫外線適合マイクロプレートに、160マイクロリットルのアデノシンを追加し、続いて40マイクロリットルの希釈タンパク質サンプルをトリプリケートで追加します。

各ウェルの吸光度を260ナノメートルで30分間、摂氏37度で測定します。データ分析の場合は、データをスプレッドシートにエクスポートし、最初の数分間の時間の関数として吸光度データの線形領域の傾きを決定します。プールされたヒト血清または PBS からなるネガティブコントロールの傾きを、酵素と血清混合物、および酵素と PBS 混合物の傾きからそれぞれ減算します。

最後に、調整されたすべての傾きを 0 時間の時点における元の傾きに正規化して、方程式を使用して残りのアクティビティの割合を取得し、残りのアクティビティの割合と時間をプロットします。野生型HsADA1活性は、プールされたヒト血清中で、1x PBSと比較して5日間でより急速に減少しました。野生型HsADA1の吸光度低下曲線は、5日目と比較して0日目の初期傾きが急であることを示しました。

ネガティブコントロールサンプルは、酵素サンプルと比較して吸光度の変化が無視できることを示しました。