再生と薬物効果を研究するためのヒト卵巣上皮単分子膜およびオルガノイドの開発

まず、凍結保存されたヒト卵巣表面上皮細胞を解凍します。細胞を10ミリリットルの洗浄培地と混合します。細胞を遠心分離した後、ペレットを2ミリリットルの卵巣表面上皮またはOSE 2D培地に再懸濁し、12ウェルプレートの2つのウェルに移します。

1ミリリットルの追加のOSE 2D培地をウェルに加え、最初の培地更新の前に、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで摂氏37度で72時間培養します。Trypan Blue染色を使用して、新たに単離または凍結保存された融解した生きたヒト卵巣表面上皮細胞を自動セルカウンターでカウントします。1ミリリットルの氷冷OSEオルガノイド塩基性培地に所望の細胞数を混合し、チューブを240Gで5分間遠心分離します。

ピペットを使用して、細胞ペレットを氷冷した原液基底膜抽出液に再懸濁して、10マイクロリットルあたり10, 000個の細胞を得る。予め加温したマルチウェルチャンバースライドに、ウェルあたり10マイクロリットルのOSE基底膜抽出液を加え、プレートを逆さまにして摂氏37度で5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーターに15分間置きます。ゲルが固まったら、100マイクロリットルのOSE 3D培地を加え、5%の二酸化炭素を含む加湿インキュベーターで摂氏37度で培養します。

使用済みの培地を取り除いた後、各ウェルに100マイクロリットルの氷冷アドバンスドDMEMF12を追加します。P1000ピペットチップでウェルの底をこすり落とし、ゲル液滴を剥離し、浮遊する各ゲル液滴を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを240 Gで5分間遠心分離します。

上清を廃棄した後、ペレットを300マイクロリットルの細胞解離緩衝液に再懸濁し、チューブを摂氏37度の予熱ビーズ浴に5〜10分間置きます。次に、300マイクロリットルのヒトOSEオルガノイド塩基性培地を加え、240Gで5分間遠心分離します。最後に、ペレットを所望の量の原液基底膜抽出液に再懸濁して、培養に適した比率で再播種します。

初代ヒトOSE細胞は、継代3までは丸石のような形態を示しましたが、その後は老化の兆候を示しました。新たに単離されたOSE細胞由来のヒトOSEオルガノイドは、培養14日後に2次元増殖したOSE細胞由来のオルガノイドよりも大きく成長しました。3D OSEオルガノイドでは、嚢胞性、単層、多層、非内腔化細胞クラスターなど、さまざまな形態が観察されました。