まず、健康で退化したショウジョウバエのフライアイ画像を同じフォルダに配置します。実験グループを識別し、男性と女性を区別するために、ファイルに適切な名前が付けられていることを確認してください。Ilastikソフトウェアを開きます。
[Create New Project] をクリックします。次に、[Other Workflows]から[Cell Density Counting]を選択し、プロジェクトファイルを保存する場所を選択します。順番に、1をクリックします。
[データの入力]、[新規追加]、および [個別の画像の追加] をクリックして、標準画像を選択します。次に、2をクリックします。Feature Selectionを選択し、フィーチャーを選択します。
感度を上げるには、より多くのシグマ値を選択します。3をクリックします。カウントして、フォアグラウンド シグマ値を 5.00 に設定します。
フォアグラウンドツールを使用して、標準画像に50個以上の個々のommatidiaをマークします。3をクリックします。もう一度カウントし、背景ツールを使用して、オマティディアの外側の領域をマークします。
オマティディアの周りに格子状に緑色の線を引きます。4をクリックします。密度のエクスポートを選択し、画像設定のエクスポートを選択して画像設定を調整します。
次に、[出力ファイル情報]をクリックし、Flynotyperでさらに分析するために形式tiffを選択します。5をクリックします。バッチ処理、生データファイルの選択、分析するすべての実験的なハエの写真を選択します。
解析するインポートされた画像のリストは、[生データファイルの選択]の下に表示されます。5の下部にある[すべてのファイルを処理]をクリックします。バッチ処理セクション。
ソフトウェアが処理を完了した後、実験的なフライアイ画像が格納されているフォルダを確認します。名前が付けられた黒い画像 (サンプル名の確率) が存在することを確認します。ImageJ で、Imastik で生成された tiff ファイルを開きます。
長方形選択ツールを使用して、目の周りに長方形を作成します。[コントロール X] または [コントロール C] を選択して領域をトリミングし、四角形のアウトラインの形をしたブラック ボックスが表示されるのを待ちます。順番に、[ファイル]、[新規作成]、および[内部クリップボード]をクリックして、トリミングされたフライアイを開きます。
カットしたフライアイをJPEGとして保存するには、[ファイル]、[名前を付けて保存]、[JPEG]の順にクリックします。ImageJで、Pluginsをクリックし、Flynotyperをクリックします。[Genotypes] で [Add Genotypes] を選択し、カットされたフライアイ画像を含むフォルダーを開きます。
「Light Microscope」と「Vertically」のボックスにチェックを入れます。次に、[Rank Ommatidia By]で、[Stability]ボックスと[Distance to the Center]ボックスをオンにします。考慮されるランク付けされたommatidiaの数については、入力を200に設定します。
[実行] をクリックし、解析の結果が表示されるのを待ちます。サンプルファイルとPスコアをコピーして統計ソフトウェアに貼り付け、さらに分析します。Ilastikで処理し、リングライトの下で分析したショウジョウバエの眼の画像は、リングライトのないものと比較して、より鮮明な眼球パターンを示し、定性的評価を強化しました。
Flynotyper解析では、中等度および重度の退化したハエの眼では、非変性眼と比較して有意に高い表現型スコアが示されました。Ilastikを使用しない場合、非変性眼と中等度変性眼の間のPスコアは類似していました。
