まず、トランスジェニック幼虫をガラス底のマイクロウェル皿の低融点アガロースに埋め込みます。皿を倒立顕微鏡の顕微鏡ステージに置きます。アブレーションの目的の領域を視野の中心に配置し、焦点を合わせます。
Zスタック設定を選択して、オペラクルの全幅を画像化します。アブレーション前の眼窩の関心領域を画像化します。次に、選択した2D平面に直径25マイクロメートルの円形領域を描画します。
関心領域、またはROIツールを使用してオペクルに焦点を当てます。アブレーションを実行するには、目的せずに測定したアブレーションパワーを450ミリワットに10秒間適用します。選択した領域を2光子レーザーにさらします。
アブレーション後、アブレーション前に使用したのと同じ設定で同じZスタックをイメージングすることにより、アブレーションを構造的に確認します。鉗子または解剖針を使用して、低融点アガロースから幼虫を慎重に取り出します。まず、幼虫を覆っているアガロースの層を取り除きます。
次に、幼虫と直接接触しているアガロースを取り除きます。幼虫を純粋なE3培地のある皿に戻します。病変後4〜6時間で、同じ顕微鏡の同じ環境でアガロース包埋幼虫を使用してオペクル領域を再画像化します。
フィジーで画像を処理した後、核ラベルで細胞を定量するか、細胞が重なっている場合は面積を測定して定量します。領域を定量化するには、マクロファージを囲むマスクを作成します。画像、調整、しきい値ツールを使用し、ROIを作成し、粒子を分析します。
次に、面積を測定します。適切なソフトウェアを使用して測定結果をプロットしたグラフを生成します。アブレーションされたオペクル領域におけるマクロファージの有意な蓄積は、受精後6日間の幼虫のアブレーション後6時間で検出されました。
受精後4日目の幼虫では、病変後4時間でマクロファージの数が増加した。マクロファージの数と面積は、アブレーションされていない状態と比較して、病変後4時間で増加しました。
