まず、500マイクロリットルのタンパク質フリー画像バッファーをフローセルのチャネル3に追加します。出芽酵母NAP1の2ナノモルとLD655標識H4ヒストンオクタマーの2〜5ナノモルを500マイクロリットルの1X HRバッファーと混合します。この混合物をフローセルのチャネル4に加えます。
すべてのチャンネルを1.0バールで30秒間流し、サンプルで洗い流します。流量を0.2 barに設定し、光トラップをチャンネル1に移動して、ストレプトアビジン被覆ビーズの適切なペアをキャッチします。次に、光トラップをチャネル 3 に移動します。
流れをオフにし、ビーズペアの強制キャリブレーションを行います。赤色共焦点レーザーをオンにし、イメージング領域をキャリブレーションします。流量を0.2バールに設定した後、光トラップをチャンネル2に移動して、ビオチン化DNAを捕捉します。
次に、光トラップをチャネル 3 に移動し、フローを停止します。光トラップ間の距離を長くしてDNAを伸ばし、関連する強制距離曲線を監視して単一のDNAテザーの存在を確認します。DNAテンションが約1ピコニュートンを読み取るように、光学トラップ間の距離を調整します。
ラインスキャンをオンにすると、赤色レーザーがオンの状態でキモグラフの収集が開始されます。次に、光トラップをチャネル4に移動し、フローをオフにしてDNAテザーに沿ってヌクレオソームを形成します。ヌクレオソームをアンラップするには、光トラップをチャネル3に移動します。
力の読み取り値を0に、速度を毎秒0.1マイクロメートルに設定して、光トラップ1を光トラップ2から離します。10ナノモルのCy3標識リンカーヒストンH1.4を500マイクロリットルの画像バッファーに混合し、チャネル5に添加します。ヌクレオソームを含むDNAテザーを形成した後、赤色レーザーに加えて緑色レーザーをオンにし、光トラップをチャネル5に移動して、クロマチンへのH1結合のリアルタイムイメージングを実現します。
DNAテザーに沿ったヌクレオソーム形成は、2Dスキャンとキモグラフで静止した赤色蛍光病巣として視覚化されました。光退色分析では、1ステップまたは2ステップの光退色イベントが示され、モノヌクレオソームの存在が示されました。NAP1が存在しないと、ヒストン八量体はDNAに結合しましたが、ほとんどは包まれていないままであり、一定の張力によって示されます。
Cy3標識H2Aを用いて、LD655標識H4と同様のヌクレオソーム集合結果が得られました。ヌクレオソームのアンラッピングは、キモグラフで確認できる時間とともにテザー距離を増加させ、個々のヌクレオソームのアンラッピングを示す特徴的な裂け目を伴う強制距離曲線を生成しました。リンカーヒストンH1のクロマチンへの結合は、H1のヌクレオソームへの結合を表す2色の静止軌道と、拡散するH1軌道を表す緑色のギザギザの軌跡を持つ緑色の蛍光病巣で示されました。
