ベクターサンプル中のAAVウイルスゲノム力価の信頼性の高い定量のための液滴生成およびデジタル液滴PCR

まず、DNAの処理済みAAVサンプル1つとdd_PCRマスターミックスを調製します。希釈したサンプル2.2マイクロリットルをPCR8チューブストリップの各チューブで19.8マイクロリットルのdd_PCRマスターミックスに加え、よく混合します。液滴発生カートリッジの中央のサンプル列に含まれるウェルに20マイクロリットルの混合物を移します。

次に、60マイクロリットルの液滴発生油を液滴発生カートリッジの下部油列に含まれるウェルに移します。液滴発生カートリッジにゴム製のガスケットをかぶせ、液滴発生器に入れます。液滴が生成されたら、8チャンネルピペットを使用して、液滴生成カートリッジから42.5マイクロリットルの溶液をマルチウェルPCRプレートにゆっくりと移します。

ヒートシール機を使用して、PCRプレートをアルミホイルカバーで180°Cで5秒間密封します。増幅するには、プレートを96ディープウェル反応モジュールを備えたサーマルサイクラーに入れ、しっかりと閉じてPCRプログラムを実行します。完了したら、プレートを液滴リーダーにロードし、必要な情報をシステムソフトウェアに入力して、読み取りを開始します。

1D振幅プロットでは、正と負の液滴の明確な分離が観察され、測定が成功したことを示唆しています。2 番目の 1D 振幅プロットでは、正の雲と負の雲の間に水滴が散らばった液滴が示されており、測定精度に問題がある可能性が示されています。AAV ランからの出力データは、1 つのサンプルを 2 つの異なる希釈率で重複して測定した場合、一貫した結果を示しました。