まず、植物組織からDNAを抽出し、DNA濃度を決定します。必要な成分をすべて0.2ミリリットルの遠心分離管に追加した後、反応を設定します。プライマー増幅後、PCR産物の3マイクロリットルと5,000塩基対のDNAマーカーの2マイクロリットルをアガロースゲルのウェルにロードします。
電圧を120ボルト、電流を400ミリアンペアに設定し、電気泳動を40分間実行します。汎用性の高いゲル画像解析システムを使用して、ゲルの結果を表示および解析します。シーケンシングユニットでサンプルを実行した後、[Create a New Project]を選択し、[Okay]をクリックしてソフトウェアのホームページに移動します。
[ファイル] メニューで [サンプルのインポートと追加] を選択します。シーケンストレース形式のファイルを選択し、未アセンブルサンプルで処理するファイルとしてインポートします。[Contig] を選択します。
次に、[Advanced Assembly]に移動し、[Assemble in Groups]を選択します。名前の定義を求めるダイアログが表示されたら、「サンプル名パーツの定義」セクションでファイル名を変更し、「アセンブリ」をクリックして整列シーケンスを表示します。「Go」を選択し、「Search Sequence」を選択し、「Okay」をクリックして一致するシーケンスを見つけます。
[Contig] を選択し、[Delete] を選択して、5.8S と 28S の領域と、低品質のシーケンスを削除します。スプライスされたシーケンスを含む出力をエクスポートして、マッチングします。NCBIのNucleotide Databaseを使用してBLAST検索を選択します。
種同定ツールと、Global Pharmacopoeia Genome Databaseに対応する特異的プライマーITS-2を選択します。NCBIからAngelicaの3種とPeucedanum praeruptorumの1種の配列をアウトグループとしてダウンロードします。これらの配列を、得られた結果配列とともに解析します。
次に、[ファイル] をクリックします。[ファイルまたはセッションを開く]を選択してファイルをインポートすると、ダイアログが表示されます。Alignを選択し、次にDNAを選択し、配列比較のためにAlign by ClustalWを選択します。
系統発生に移動し、[Construct Test Neighbor Joining Tree] をクリックして系統樹を生成します。ゲル電気泳動の結果、サンプルAS1、AS2、AS3では約500塩基対の単一の明確なバンドが示され、ネガティブコントロールにはバンドはなく、抽出されたDNAの増幅が成功したことを示しています。シーケンシング結果では、BLASTを使用して100%の配列類似性を持つAngelica sinensisが同定され、GPGDデータベースの結果と一致しました。
系統解析では、スプライシング配列はAngelica sinensis OR8797150.1とクラスター化され、ブートストラップサポート値は100であり、Angelica sinensisとしての同定が証明されました。
