研究資源、国立衛生研究所のナショナルセンターからバンダービルトCTSA助成金1 UL1 RR024975によって部分的にサポート。この作品は、NIHのR01 HL 83839によって賄われていた。R01 AI 65744。

次のプロトコルの場合、我々は目的の細胞として末梢血単核細胞（PBMC）を使用します。しかし、このプロトコルは、他の細胞型で使用できます。無菌操作を用いて組織培養フードのアッセイを実行します。 1日目：プレートと細胞の作製<ol><li> ELISPOTプレートを取り出し、フードで開きます。 </li><li>可能な場合、そうでない場合は、単一のよくピペッティングが許容される、マルチチャンネルピペッターを使用して1 × PBS 150μLでプレートを3回洗浄。 </li><li>貯水池のパッケージを取り出し、フードで開きます。 </li><li>濃度2μg/ mLの捕捉抗体の、抗ヒトインターフェロン-γ、11〜1 × PBSのMLS。を追加よく渦。貯水池への抗体のミックスを転送する。 </li><li>マルチチャンネルを使用して各ウェルにコーティング溶液の代わりに100μL。 </li><li>パラフィルムでプレートを包みます。 </li><li>一晩冷蔵庫にプレートを置きます。プレートは、週に適しています。経験則では、井戸の液体左がまだ存在する場合、プレートを使用できることです。 </li></ol>細胞の準備末梢血単核細胞が新鮮な場合はその後37℃で細胞をカウントし、一晩インキュベート° Cを5％CO 2で。液体窒素に保存されたPBMCの場合、細胞の凍結融解することが必要です。次のようにプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>ほぼ完全に融解するまで37でのセルのクライオバイアル℃の水浴を解凍。 </li><li>すぐにR10メディア5mLに懸濁します。 </li><li> 225 × gで5分間スピン</li><li> R10メディア5mLに再び懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える。 </li><li> R10メディアに2 × 10 6細胞/ mLに濃縮をもたらす。 </li><li> ° C、5％CO 2で一晩37休憩。 </li></ol> 2日目：設定アッププレート<ol><li>検体の識別番号、うまく条件、および日付とラベルのプレートのふた。 </li><li>ダンプとブロット法を用いて滅菌1X PBSを150μLでプレートを6回洗浄する。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。これはプレートのウェルが紫にする可能性があります。 </li><li>各ウェルにR20 100μLを加える。 </li><li> 37プレート℃で1時間インキュベートします。 </li><li>プレートがインキュベートされている間、一晩休息された細胞を数える。 </li><li> 5分間1500rpmで細胞懸濁液をスピン。上清をデカントし、R10メディアに1mLの当たり1X10 6細胞の最終濃度を持つようにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1時間のインキュベーションの後、R20ダンプとブロット法を用いて取り除く。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。 </li><li>各ウェルに細胞溶液100μL（10 5細胞）を追加します。重複しての対応するウェルに適切なペプチドおよび/または抗原を追加。新しいピペットチップ、あなたがペプチドワーキング溶液中に行くたびに使用してください。通常のペプチドの濃度は10〜40μg/ mLとなります。ペプチドが異なるため、各研究者が最適な結果を得るためにペプチドを滴定してください。 </li><li>ネガティブコントロールウェルでは、セルだけを（無ペプチド）を追加</li><li>ポジティブコントロールウェルでは、フィトヘマグルチニンを（、10μg/ mLの、シグマPHA）を追加。 </li><li> 37℃で一晩インキュベート° C、5％CO 2（〜18時間）。 </li></ol> 3日目：プレートの開発<ol><li>ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用してプレートの各ウェルに100μLのPBSを追加。 </li><li> 15分間冷蔵庫にプレートを置く。 </li><li>冷蔵庫の外板を取り出し、組織培養フードに入れてください。 </li><li>ビオチン抗体溶液を準備する<ul><li> 11mL PBSにビオチンの抗体0.5μg/ mLの（MAB 7 - B6 - 1）を追加します。 </li><li>渦うまくミックスするソリューション。 </li><li>マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。 </li></ul></li><li>くずかごにそれをフリックでPBSを捨ててください。ダンプしながらプレートを飛散しないように注意してください。 </li><li>各ウェルに溶液100μLを置きます。 </li><li> 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。 </li><li>ダンプとブロット法を用いて150μL1xPBSでプレートを6回洗浄する。あなたがストレプトアビジン抗体を準備するまで6 回の洗浄では、プレートにPBSを残す。 </li><li>ストレプトアビジン抗体を準備します。 <ul><li> 11mL PBS（1:2000希釈）、5.5μlのストレプトアビジン抗体（ストレプトアビジン- ALP）を追加します。 </li><li>渦うまくミックスするソリューション。 </li><li>マルチチャンネルを使用してソリューションを追加することを計画している場合、貯水池にそれを注ぐ。 </li></ul></li><li>プレートに残ったPBSを捨て、プレートを覆い隠す。 </li><li>各ウェルにストレプトアビジン溶液100μLを加える。 </li><li> 1時間室温で組織培養フードにプレートをインキュベートする。 </li><li> PBSは、ダンプとブロット法を用いてプレートを6回洗浄する。あなたが色のソリューションを確保するまでの6 番目の洗浄では、プレートにPBSを残す。 </li><li>暗闇の中で働く。アルカリホスファターゼの基質溶液（アルカリフォスファターゼ基質キットIV BCIP / NBT）を準備します。 <ul><li>基質試薬1〜11 mLのトリス緩衝液、よく渦の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬2の4滴を追加します。トリス緩衝液、よくボルテックスする基質試薬3の4滴を追加します。 </li></ul></li><li>残りのPBSを捨て、プレートを覆い隠す。 </li><li>マルチチャンネルを使用してプレートの各ウェルに色溶液100μLを加える。 </li><li>発色の5〜10分後にライトをオンにします。 </li><li>スポットがパープルに変わり始めるとかなり暗くなるまで、色試薬はプレートにしておくことができます。これは、5〜20分くらいかかりますがあります。そうする高いバックグラウンドを引き起こす可能性があるため長すぎるの基質溶液を残さないように注意してください。 </li><li>水道水でELISPOTプレートを3回洗浄。 </li><li>約時間または一晩乾燥さおきます。 </li><li>手動またはELISPOTプレートリーダーでプレートをお読みください。 </li><li>露光から離れボックスでプレートを保管してください。 </li></ol>代表的な結果： ELISPOTは、微生物抗原に対する免疫応答を定量化するために設計されています。各スポットには、興味のあるサイトカインを表現する、単一の応答性細胞を示している。スポットは、手動またはELISPOTプレートリーダーを使用してカウントすることができます。 ELISPOTが正しく行われていることを評価に関心のサイトカインの背景に生産のための陰性対照の調査から始める必要があります。少し背景（紫色）が存在する可能性はありますがネガティブコントロールウェルでは、1つは、ないのスポットを表示しないことを期待する。一般的に、よくあたり5箇所の平均よりも小さいがあるはずです。ポジティブコントロールのウェルは、反応が正しく行われていること、および細胞が抗原刺激に応答することを確認してください。ポジティブコントロールウェルでは、スポット（Fig1）の合流により、深い紫色の背景を見ることが期待される。ない白い背景はほとんどないはずです。ポジティブコントロールとネガティブコントロールサンプルが適切である場合、一つは、目的の抗原を含むウェルをカウントできます。 &quot;次善の&quot;結果は、高バックグラウンド（井戸は紫）、無斑または非常に少数の斑点、ブランクセンター、不十分な定義スポットまたはコンフルエントスポットが反映されます。トラブルシューティングのヒントのリストは、（表1）提供されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> 図1。ELISPOTプレートの代表。各プレートは2つのウェル内で最低で行われたポジティブコントロール、ネガティブコントロールと目的のペプチドが含まれている必要があります。深い紫色、コンフルエント細胞とほとんどない白色の背景があるかあなたが見ることができるようにC9、C10、D9とD10は、陽性コントロールウェルです。ネガティブコントロールのウェルは、G11、G12、H11とH12です。これらの井戸は紫色の背景と、期待どおりのないスポットがありません。スポットG7、G8、H7やH8は、微生物ペプチドに対する細胞応答を示し、紫色の斑点は、関心のサイトカインを発現している単一の応答性細胞を表しています。 表1 <table border="1"><tbody><tr><td>観測</td><td>可能な問題</td><td>考えられる解決方法</td></tr><tr><td>高いバックグラウンド</td><td> 1。膜の両側には、適切に洗浄しない 2。あまりにも多くの細胞が分泌するサイトカイン 3。プレートは、適切に乾燥しない 4。開発したプレート上に</td><td> 1。発色の前と後の蒸留水で膜の両面を洗います。試薬は、プレートの底に膜を介して漏洩する可能性があります、と洗い流されていない場合は、これらは、高いバックグラウンドを引き起こす可能性があります。 2。ウェルあたりの細胞数を減らす、これは最適化が必要になります 3。読む前にプレート長く乾燥させる 4。開発時間を短縮</td></tr><tr><td>いいえスポットなし/非常に少数のスポット</td><td> 1。興味のない十分な細胞が分泌するサイトカイン/タンパク質 2。細胞が正しく刺激されていることを確認 3。 lを格納するためにインキュベートしていない細胞十分なオングや刺激への応答に時間がかかることがあります 4。不十分な発色 5。十分な一次または二次抗体</td><td> 1。セルの数を増やします。これは、最適化が必要になります 2。また、正の刺激のコントロールを使用してください - あなたが知っている興奮剤は、目的のサイトカイン/タンパク質の発現を誘導する 3。細胞のインキュベーション時間を増やすか、または間接的な方法を（覚せい剤による前御馳走細胞）を使用してください 4。オーバーヘッド顕微鏡で発色を監視し、開発する試薬が正しく保存されていると活性を失っていないことを確認してください 5。プライマリおよび/または二次抗体の濃度が増加する必要があります。これは、最適化が必要になります。 </td></tr><tr><td>ブランクエリア</td><td> 1。膜前処理ではない 2。膜は、いくつかの段階で乾いている 3。細胞が偏在</td><td> 1。膜は、70％エタノール（すべての膜はこのようにあなたのサプライヤーに確認は必要ありません）と十分に前処理であることを確認してください。その後PBS 3Xでよく洗う 2。膜が乾燥しないように 3。あなたが井戸に出てピペッティングの前に良い相同な細胞懸濁物を持つように穏やかに細胞を混ぜていることを確認</td></tr><tr><td>ブランクセンター</td><td> 1。洗濯による被害</td><td> 1。自動洗濯機（またはピペッティング）で流量が高すぎる可能性があります。もっと穏やかに洗浄の手順を必要とする</td></tr><tr><td>偽陽性</td><td> 1。二次抗体の凝集体 2。まだ膜上で細胞 3。細胞培養の汚染</td><td> 1。二次抗体をフィルタリング 2。すべての細胞は二次抗体のインキュベーションの前にPBS Tween 20を有する膜から洗浄されていることを確認します。メンブレン上に残って細胞は不規則な形の斑点を与える 3。可能な限り無菌でクリーンな試薬を保管してください。あなたの細胞培養技術は無菌であることを確認してください。メディアのネガティブコントロールを実行することにより、偽陽性を確認してください。プレート運動のために、 <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">不完全に定義されたスポットを参照してください。</a> </td></tr><tr><td>コンフルエントスポット</td><td> 1。貧しいコーティング、あまりにも多くの抗体 2。長期細胞培養 3。細胞が過剰刺激</td><td> 1。一次抗体の濃度を減少させる 2。長い細胞がインキュベートされ、より多くのサイトカイン/タンパク質、それらが分泌されます。これは、マージと区別がつかないになるために開始される大規模なスポットになります。 3。細胞培養工程のインキュベーション時間を減らす。過剰刺激は、細胞によって分泌されるサイトカイン/タンパク質の多くになります。これは、マージと区別がつかないになるために開始されるスポットを生成します。短い時間のための培地または培養で刺激の量を減らす</td></tr><tr><td>不完全定義されたスポット</td><td> 1。膜ではない前処理は、（あなたの膜がこれを必要とする場合、供給者に確認してください） 2。細胞のインキュベーション中に、プレートの動き</td><td> 1。膜をエタノールで前処理する必要がありますかこれはファジー、不十分な定義のスポットになる可能性があります。読者はこれらを区別することは難しいだろう 2。プレートは複数のスポットを作成するに移動している細胞と細胞のインキュベーション中に移動させないようにしてください。可能であれば、インキュベーション中には開かれません、専用のインキュベーターを使用してください。セルを追加した後にプレートをタップしないでください。 </td></tr><tr><td>ポジティブコントロールのウェルは低いです。 </td><td> 1。低開発は - ストレプトアビジン- ALPおよび/または室温に移されていないBCIP / NBTソリューションを使用しての結果である可能性があります</td><td> 1。ウェルに追加する前に室温に試薬をもたらす</td></tr><tr><td>スポットの密度は、それが困難なそれらを定量化することができます</td><td> 1。あまりにも多くの細胞がウェルに添加した</td><td> 1。明確なスポットの形成につながる細胞の最適な数を決定するために、細胞の希釈（すなわち、1 × 10 6、5 × 10 5、1 × 10 5、5 × 10 4、1ウェルあたり× 10 4細胞）を作る</td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ELISPOTアッセイは、ヒトおよび他の種の様々な免疫応答を監視するために最も重要で広く使用されているアッセイの一つとして浮上している。 ELISPOTアッセイにより、免疫細胞の頻度は、細胞集団の拡大または操作することなく、単一細胞レベルで測定することができます。 ELISPOTアッセイは広く感染症、がん、アレルギー、自己免疫疾患を含む種々の疾患で抗原特異的免疫応答を調査するた?...

メディアのA.の準備<img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="材料" />トリス緩衝液のB.準備<ol><li> 1リットルのビーカーにのddH 2 O 800mlを追加します。 </li><li>トリスの12グラムを測定し、ビーカーに加える。 </li><li>ビーカーに：塩化マグネシウム六水和物の0.12グラム（6H 2 O のMgCl 2）を追加します。 </li><li>自動攪拌プレート上で磁気撹拌棒で撹拌する。 </li><li>一度9.5に解決策は、pH、溶解した。 </li><li> 1000mLにそれを育て、ビーカーにのddH 2 O 200mLを追加します。 </li><li> 0.22μmのフィルターを備えたソリューションをフィルタリングする。 </li></ol> ELISPOT解析に必要なC.材料： <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="材料B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

適応免疫は、細胞内病原体のクリアランスに重要なコンポーネントです。ヒトではこれらの応答を検出し、定量化する能力は重要な診断ツールです。酵素結合immunospotアッセイ（ELISPOT）は、HIV感染、移植患者など免疫抑制集団、およびステロイドの使用を含む、微生物抗原に対して細胞性免疫応答を識別する能力のため人気を集めている。このアッセイは、特定の微生物の抗原に対する免疫応答を定量化する能力を有し、同様にこれらの応答がTh1または文字のTh2のかどうか区別する。 ELISPOTは、炎症部位に限定されるものではない。それは、末梢血、だけでなく、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液、腹水など、積極的な関与のサイト内での免疫応答のために評価する能力に汎用性があります。単一または複数の抗原に対する免疫応答の検出が可能であるだけでなく、微生物のタンパク質内の特定のエピトープ。このアッセイは、時間の経過とともに免疫応答の検出だけでなく、ホストのT細胞が認識する抗原の違いを容易にします。デュアルカラーELISPOTアッセイは、2つのサイトカインの同時発現の検出のために用意されています。このテクニックのための最近のアプリケーションは、肺外結核の診断だけでなく、自己免疫疾患に感染抗原の寄与の検討が含まれています。

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

特発性疾患における適応免疫の微生物のターゲットの同定、酵素結合immunospotアッセイの使用により達成することができます。

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.7K ビュー.  Vanderbilt University School of Medicine. 特発性疾患における適応免疫の微生物のターゲットの同定、酵素結合immunospotアッセイの使用により達成することができます。

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

免疫・感染学

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化

要約

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ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリンアイソタイプ反応の評価

ワクチン接種後のモルモットモデルメジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

要約

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ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞性免疫応答の定量化

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリンアイソタイプ反応の評価

ワクチン接種後のモルモットモデルメジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ