過去には、モルモットモデルにおける免疫療法の特徴付けは、液性免疫の測定に限られていた。ELISpotアッセイはその制限を克服し、研究者がその動物モデルでより有意義なデータを生成するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が末梢血から得られるということです。
壊死は必要ありません。これは、自然感染中またはワクチンレジメン全体で個々のモルモットにおける大きさだけでなく、T細胞応答の運動学の測定も可能にする。手順をデモンストレーションすることはホリー・ピューになります。
彼女はイノビオの前臨床RとD部門の研究員です。ELISpotアッセイプレートの各ウェルに35%エタノールの15マイクロリットルを加え始める。60秒後、各井戸に150マイクロリットルのPBSを加えます。
そして、エタノール前処理を停止するためにプレートを反転します。また、ELISpotアッセイプレートを取り扱う際には、膜の汚染や損傷を避けるために細心の注意を払う必要があります。プレートを洗浄するには、各ウェルに250マイクロリットルのPBSを加える。
さらに2回洗浄を繰り返した後、100マイクロリットルの捕獲抗モルモットインターフェロンガンマ抗体VE4を各ウェルに加える。その後、4°Cで少なくとも12時間プレートをインキュベートします。インキュベーション期間の後、プレートを3回洗浄します。
各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファを加えます。プレートを室温で2時間インキュベートします。その後、プレートをさらに3回洗います。
4.5 ml の室温密度勾配媒体を備えた円錐管を準備します。その後、ハンクスのバランスのとれた塩溶液の等しい量を血液と混ぜます。希釈した血液を密度勾配培地の上に徐々に重ね、界面を乱さないで注意する。
この後、室温でブレーキなしで30分間800 x gでチューブを遠心します。遠心分離機からチューブを取り出し、層を乱さないで注意してください。正しく層を吸引した後、PBMCを収穫するために完全なバフィーコート層。
HBSS希釈血液を密度勾配培地にゆっくりと重ね合わせた。チューブの乱れを避け、遠心分離機のブレーキをオフにします。新しい15mlチューブに細胞を移します。
その後、R10培地中の細胞を合計15mlに希釈します。細胞をペレット化した後、上清を捨て、15mlのR10培地で細胞を再懸濁する。70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して新しい管に細胞懸濁液を渡す。
細胞を数え、トリパンブルー除外テストで生きている細胞の数を決定します。その後、R10培地で細胞を希釈します。まずブロッキングバッファを取り出し、プレートを洗います。
各PBMCサンプルについて、陽性対照の三重化、陰性対照、および各実験特異的刺激剤を示す。R10培地でタンパク質ペプチドプールを、望ましい最終濃度の3倍に希釈します。この後、プレートの覚醒剤試験井戸に50マイクロリットルのペプチドR10培地混合物を加える。
次に、R10培地中のMTペプチド製剤の50マイクロリットルをプレートの陰性対照ウェルに加える。プレートの正の制御ウェルにR10培地にConAを加え、PBMC懸濁液の100マイクロリットルをすべてのウェルに加えます。ELISpotプレートをインキュベーターの偶数面に置き、インキュベーション期間中にプレートを乱さないようにします。
インキュベーターからプレートを慎重に取り出した後、プレートを反転させて上清を除去します。その後、プレートを3回洗います。希釈されたビオチン化検出キャプチャの100マイクロリットルを各ウェルに抗モルモットインターフェロンγ抗体N-G3を加えます。
その後、室温でプレートを2時間インキュベートします。プレートを反転して抗体溶液を取り除き、洗浄を3回繰り返します。プレートからPBSを取り出した後、各ウェルにブロッキングバッファーで希釈したALPコンジュゲートストレプトアビジンの100マイクロリットルを加える。
その後、室温でプレートを1時間インキュベートします。プレートを反転してALPストレプトアビジン溶液を廃棄し、プレートを2回洗浄します。プレートを反転し、余分なPBSを取り除くためにきれいなペーパータオルに対してそれをブロットします。
この後、ウェルあたりウルトラピュアDI水の250マイクロリットルでプレートを洗浄します。プレートを反転し、きれいなペーパータオルで余分な水を取り除きます。次に、各ウェルに100マイクロリットルのBCIP/NBT基板溶液を追加します。
プレートを室温で20分間、光から保護してインキュベートします。プレートをDI水で4回リンスします。その後、余分な水を除去するためにプレートを反転し、タップします。
最後に、プレートの底部からプラスチック排水を取り除き、膜を完全に乾燥させます。先に示したように、密度勾配遠心分離が成功した後、チューブの下部にある赤粘性液体は、赤血球のほとんどを含む必要があります。バフィーコート層は、プラズマ層と密度勾配媒体の間にある。
捕獲抗体を加える前にウェルを前処理し、アッセイは陰性対照ウェル内の非特異的スポットの数の減少と共に改善された定義を示した。スポットは、PBMC集団内でT細胞を産生するインターフェロンガンマを示す。この技術を試みるとき、慎重に、しかし迅速に血液を処理することを覚えておくことが重要です。
これにより、細胞の生存率が向上し、スポット形成が改善され、非特異的スポットの形成が減少します。血液およびBCIP/NBT基質での作業は危険であり、適切なPPEを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。このプロトコルは、研究者が結核、エボラ出血熱、HSVなどの重要なT細胞成分を持つ疾患を研究することを可能にすると信じています。
重要なことに、モルモットモデルにおけるワクチンプロトコルの開発を改良し、関連性の低い動物モデルの使用を減らすことです。
