この作品は、NIHの助成金P20 RR021905 - 01、CF RPD助成STANTO07R0、と米航空宇宙局（NASA）の助成金NNH09ZNE002Cによって運営されている。

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。細菌の揮発性物質のSESI - MS分析のための回路図。細菌培養のヘッドスペースはSESIの反応室（2）にCO 2（1）で変位される。揮発性SESIの反応室を通過する際に、彼らは、エレクトロスプレー雲を通過し、（3）イオン化となる。一回電離した、揮発性物質分析用質量分析計（4）に引っ張られている。過剰キャリアガスと未反応の細菌の揮発性物質は追加の保護措置として、0.22μmのフィルター（5）を通過し、化学フードに通気されています。挿入図：SESIのエレクトロスプレーニードルは、尖った針の先端のキャピラリーシリカ（40μmのID）です。 細菌の揮発性物質の特性評価のためのSESI - MSの使用、E.のデモンストレーションとして大腸菌 K12およびP.緑膿菌 PAO1、37で50 mLのLB -レノックスで24時間好気的に培養されています° Cおよびヘッドスペースの揮発性物質のSESI - MSスペクトルは、2分間に収集されます。 2 L /分の流量で炭酸ガス（99.99％）を反応槽への揮発性の配信のためのキャリアガスとして使用されます。 SESIの反応室は、カスタムいました構築され、オリジナルのエレクトロスプレーイオン源を置き換えるAPI - 3000（SCIEX）に装着。スペクトルは、0.1％ギ酸、5.0％のメタノール、およびエレクトロスプレー液として94.9パーセントの水（v / v）を使用して、正イオンモードで収集5時に配信される尖った針の先端のキャピラリー非導電性シリカを介しNL /秒（40μmのID）。印加電圧は2.5 kVのです。 - 500ダ、MCAモード、40スキャン、3秒/スキャン、および2分、総分析時間は20：アナリスト1.4.2ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）は、次のパラメータを使用してデータ収集に使用されます。 1。培養システム<ol><li>あなたの実験（例えば、曝気、光、温度、等）だけでなく、質量分析計への揮発性物質の効率的な配信の種の成長要件を考慮し、自分の文化を成長させるための適切な容器を選択してください。我々が使用することを選択培養ボトルには、少なくとも2つのルアーのポートを持っているネジキャップを装備した標準的な100mlのパイレックスメディアのボトルです。サンプル瓶及び出口ラインにキャリアガスの配信用のルアーポートは機器へのVOCの配信のための別のポート（図1）を介して挿入さを通して入口ラインが挿入されます。追加のポートを塞いであります。 </li><li>培養サンプルを作成する前に、リークをチェックするために水の容器と水没を加圧する。ガス漏れは弱いか存在しない揮発性のイオン信号の形で非定型的な結果の主な原因となっています。 </li></ol> 2。生物学的実験：セットアップおよび安全性の考慮<ol><li>あなたの仮説に適切な条件で培養を成長する。それは少なくとも2つの生物学的には、各2との技術が複製、複製の各変数のために使用されることをお勧めします。 </li><li>すべての培養条件のためにブランクを準備（培地、抗生物質、等）と試料と同じ条件で空白をインキュベートする。 </li><li>考慮種のバイオセーフティレベル（複数可）を服用、使用している生物学的エージェントのための適切な安全上の予防措置を採用しています。 </li><li>楽器と実行可能な生物剤を用いたガストランスファーラインの汚染を防止するために、キャリアガスラインに適切な孔径のフィルターをインストールします。フィルタは、SESIの反応室への揮発性物質の移転を妨げることはありませんが、少しエアロゾル転送の効率が低下する場合があります。6 </li><li>生物剤をこぼしの場合に適切な封じ込めを確実にするために、培養瓶にガスの転送キャップを取り付け、二次封じ込めまたは生物学的安全キャビネットを使用してください。 </li><li>ボトル内の圧力をビルドしないようにしてサンプルのボトルへのキャリアガスの流量を開始および終了。 </li></ol> 3。楽器の最適化注記：SESI - MSは、特にサンプルの揮発するように設計されているので、楽器を使用する前に、香りのパーソナルケア商品（例えば、コロン、マウスウォッシュ、ローション、柔軟仕上げ剤）、ガム、タバコ、等の使用を制限する。しっかりとラボ内のすべての揮発性化学物質をふた、および制御の空気は、テスト中に可能な限りドラフト。 すべての信号強度と安定性に影響を与える次の機器パラメータは、、、測定器、実験用に最適化する必要があります。 <ol><li> エレクトロソリューションと流量：アカウントにオペレーティング計器の極性（正または負イオンモード）と、ターゲット化合物の分子の文字を取って、ターゲットにしたい分子のクラスのための適切なエレクトロソリューションを選択してください。この実験では、エレクトロスプレーソリューションは、0.1％ギ酸、5.0％メタノール、極性の小さい分子の信号強度を高める94.9パーセントの水（v / v）を、であるウコン優れた信号安定性を提供する電子。溶液を5 NL / sの流量で配信されます</li><li> キャリアガス流量：キャリヤーガスの流量は、エレクトロスプレーの安定性とシグナル強度に影響を与えることができる。 2 L /分の流量でCO 2（≥99.99％）ここで使用されています。 </li><li> 針の形状と位置：針先の形状と位置は強く信号強度と安定性に影響を与えます。新しいニードルを取り付けるときは、針の位置が低いバックグラウンド、高い分析対象成分の信号強度、および信号の安定性のバランスを作成するために最適化する必要があります。針の変更後にSESIのスペクトルを再現するために、それはあなたのレコードに観測されたスペクトルを一致させることになるまでは、針の位置を調整すると、定期的にスペクトルを収集する必要があります。 5ミリメートル - エレクトロスプレーニードルの先端から大量のスペックのオリフィスまでの距離は1になります。 </li><li> 印加電圧：システムに印加される電圧は、信号のイオン強度とエレクトロテイラーコーンの安定性に影響を与える。さらに、最適な電圧は、エレクトロソリューションと針の先端形状に依存しています。実験のあなたの一連の開始時に、システムに最適なスペクトラムと信号の安定性が得られる電圧を決定し、後続のすべての実験ではこの電圧を使用してください。私たちのシステムの場合は、2.0の印加電圧 - 5.0 kVのは、最適な信号強度とエレクトロスプレーの安定性を提供しています。この実験では2.5 KVが使用されます。 </li></ol> 4。電源をオンにすると分析のためのSESI - MSのチューニング<ol><li>電圧電源がオフになっていることと、システムが静電気を放電していることを確認することから始めます。電圧電源のインジケータライトがゼロのマルチメータで電圧を確保する）、2オフになっている、3）電気リードを接地の確保）1でこれを行います。 </li><li>テスト用の適切なエレクトロソリューションをインストールします。 </li><li>キャリアガスをオンにして、テスト用の適切な速度にフローを設定します。 </li><li>反応室へエレクトロソリューションの提供を開始するためにエレクトロスプレータンクに圧力を適用する。 </li><li>電圧、電源をオンにして、実験のための適切な値に電圧を調整する。 </li></ol>注：この時点で、イオン化源の金属表面には、危険な衝撃を提供することができます。電圧、電源がオンされた後に計器の周囲で作業する場合は十分気を付ける。 <ol start="6"><li>印加電圧に微調整し、調整する際のSESI - MSスペクトルを監視するためのチューニング方法を設定します。お使いのシステムや実験に最適化した収集パラメータを使用してください。 15分、および収集を開始 - すべてのスキャンが独立したスペクトル、10に収集時間を設定が生成されないようにすること（該当する場合）複数チャンネル集録（MCA）]チェックボックスをオフにします。キャリアガスのバックグラウンドのスペクトルを観察できるはずです。 </li><li>以前の実験のためのCO 2のスキャンを一致させる安定したトータルイオンクロマトグラム（TIC）と再現性のスキャンを取得するために印加電圧の微調整の調整を行います。電圧の調整を行った後、機器が安​​定していることを確認するために5分間のスペクトルとTICの収集を継続します。 </li><li>一度楽器の安定性が確保され、必要に応じて収集時間、データ範囲、およびMCAの選択を調整し、あなたのサンプルに応じて取得方法を設定します。あなたの記録のためのキャリアガスのバックグラウンドのスペクトルを収集する。 </li></ol> 5。あなたの細菌培養物の揮発性のフィンガープリントを取得<ol><li>ブランクのスペクトルを収集するには、バイパス線を介してキャリアガスの流れを指示し、楽器のガスの転送ラインに（バルブ閉）ブランクサンプルを添付。 </li><li>サンプルボトルにバルブを開いて、バイパスラインのバルブを閉じてください。 </li><li>システムは、反応室内の湿度が安定している時に、30秒間平衡させる。平衡のこの期間は、再現可能なスペクトルを得るために不可欠です。システムが平衡であることを確認するには、平衡期間中に変更されるTICを、監視したい、そして、その後安定化することがあります。 </li><li>システムが平衡になると、スペクトルの収集を開始。 </li><li>スペクトルが収集された後、最初のサンプルバルブを閉じ、そして最後に、サンプル瓶を除去し、キャリアガスのバイパスラインを開いて、サンプルのボトルを取り外します。 、トランスファーラインから水分と吸着揮発性物質を除去するサンプル間のキャリーオーバーを防止する、4分 - 2のキャリアガスを使用してシステムをフラッシュします。 </li><li>断続的に徹底したブランク減算を確保するために追加のブランクのスペクトルを収集し、それぞれの細菌サンプルに対して5.5 - 手順5.2を繰り返します。不完全なブランク減算がにつながる大気圧イオン化法に共通して処理されたスペクトルにおける化学物質のバックグラウンドピークの出現、（例えば、フタル酸エステル類、シリコーン類、等）9。 </li><li>あなたのスペクトルを収集する場合、イオンの信号がとしてTICと個々のピークの最大強度で決定される楽器の線形検出限界を、超えていないことを確認してください。ご使用の機器の検出器の上側の限界を超えるイオンは、サンプルの代表ではないアーティファクトのピークを生成することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果細菌の揮発性物質、E.のためのポジティブイオンモード揮発性の指紋を得ることができるSESI - MSスペクトルの例として大腸菌とP.緑膿菌は、° C（図2）に示されている37℃で24時間LB -レノックスで好気的に成長した。 E.大腸菌揮発性スペクトルはE.を与える、のm / z = 118でインドールによって支配されているP.のスペクトルに対し、彼らの特異臭、 大腸菌の培養緑膿菌にはプロトンのピークの種類が多くなりが含まれています。 揮発性スペクトルのピークの相対強度は、3章で説明されている機器パラメータに依存していることに注意してください。これらのパラメータは、しっかりと再現性のスペクトルを得るために実験間に制御する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="図2" /> E.の。 - 図2ブランクを差し引いた正イオンモードSESI - MSスペクトル（150のm / z 20） 大腸菌 K12およびP. 37 LB -レノックスで24時間好気生育℃の後の緑膿菌 PAO1揮発性物質をSESIスペクトルで観測されたピークの詳細については、朱、 ら8を参照してください。

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利害の衝突は宣言されません。

細菌は、細菌の同定10月12日と代謝状態の評価に利用することができる揮発性物質のさまざまな組み合わせを、作り出す。 SESI - MS法では、急速に種の同定のための細菌の&quot;指紋&quot;を生成し、任意のサンプル準備もなしに細菌の揮発性物質を（2分以内で）を特徴付けるための手段を提供するここで説明する。過去数十年で他の8大気圧イオン化は、 MSの技術は、選択的なイオンのフローチューブ（SIFT）とプロトン移動反応（PTR）質量分析を含む揮発性化合物の特性評価に適用されている。 SESIは、これらの他のイオン化法を介して提供される独特の利点は、化合物同定のための重要なツールであるフラグメント特定のピーク（SESIに適応されている質量分析装置の適切なタイプを用意）、することが可能であることです。我々は、上記のプロトコルのピークの断片化を取り上げますが、断片化情報が細菌の揮発性物質の特性評価に使用できる方法の例については、 ら 、朱を参照してくださいしていない8。 SESI - MSは、呼気分析を介して細菌の肺感染症の in situ検出のために直接アプリケーションを持っていますが、揮発性のサンプリングが可能なすべての設定にも適用することができます。例えば、代謝性疾患の診断に関連する尿、血液、及び呼気中揮発性物質の分析は、胃腸疾患、癌、および環境ばく露は、よくSESI - MSに適しています。13,14 SESI - MSはまた持っている、熟成老化、または台無しに関連付けられている特徴的な揮発性物質のための食品の迅速な分析を含めた非臨床VOCフィンガープリントアプリケーション、の広い範囲。15から18

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> API - 3000トリプル四重極</td><td>装置</td><td> SCIEX </td><td></td><td>アナリスト1.4.2（Applied Biosystems社）で購入</td></tr><tr><td> SESIイオン源</td><td>装置</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド、基準6を参照してください</td></tr><tr><td>ガス流量計</td><td>機器</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> EW - 03217〜74 </td><td></td></tr><tr><td>二酸化炭素</td><td>機器</td><td> Airgasの</td><td> CD I300 </td><td> ≥純度99.99％ </td></tr><tr><td>窒素</td><td>機器</td><td> Airgasの</td><td> NI UHP300 </td><td>超高純度</td></tr><tr><td> 100mLのガラスメディアボトル</td><td>機器</td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45ねじ</td></tr><tr><td>ルアーポート付きボトルキャップ</td><td>機器</td><td>バイオ化学流体</td><td> 00945T - 3 </td><td>キャップアセンブリ</td></tr><tr><td>ルアーポートプラグ</td><td>機器</td><td>バイオ化学流体</td><td> 009LP </td><td>キャップアセンブリ</td></tr><tr><td>チューブ1 / 4&quot;（OD）× 1 / 8&quot;（ID） </td><td>機器</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> EW - 95875〜02 </td><td>キャップアセンブリ＆ガスの転送ライン</td></tr><tr><td>チューブ1 / 8&quot;（OD）× 1 / 16&quot;（ID） </td><td>機器</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> EW - 06605〜27 </td><td>キャップアセンブリ</td></tr><tr><td> 2方弁</td><td>機器</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 07391〜04 </td><td>キャップアセンブリ</td></tr><tr><td>フィルタ、グレードAAQ </td><td>機器</td><td>バルストンフィルタ</td><td> 9922〜05 </td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、LC / MSグレード</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> A117 - 05AMP </td><td>エレクトロソリューション</td></tr><tr><td>メタノール、LC / MSグレード</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> A456 - 500 </td><td>エレクトロソリューション</td></tr><tr><td>水、LC / MSグレード</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> W6 - 500 </td><td>エレクトロソリューション</td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）は、サンプルの前処理を必要とせずに、揮発性化合物の迅速な検出のために開発された手法です。メソッドが最初にフェンと同僚1で記述されていたと違法薬物2と爆薬3-4、皮膚の揮発性物質5の特性評価、および呼吸6-7の分析の検出に適用されている。 SESIのイオン化はエレクトロスプレー液と揮発性の分析対象物との間のプロトン移動反応によって発生する、と同じように、従来のエレクトロスプレーイオン化（ESI）で、したがって、ヘテロ有機分子の分析に適しています。しかし、標準のESIとは異なり、SESIのプロトン移動のプロセスは、気相ではなく、溶液中で発生します（図1）、したがって、SESIは、最高の有機揮発性物質やエアロゾルの検出に適しています。 私たちは、細菌の同定とキャラクタリゼーション8の方法として、細菌の揮発性物質の検出にSESI - MSの使用を拡大しています。我々は、統計的分析法と組み合わせたSESI - MS揮発性のフィンガープリントが、、成長の様々なメディアで細菌属、種、および混合培養を区別するために使用できることを実証した。ここで8は、我々はSESIを使用して細菌の揮発性のフィンガープリントを取得するための手順を提供する堅牢な細菌の同定と特性評価を保証するために最適化すべき機器パラメータを含めて - MS、。

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）は、任意のサンプルの前処理を必要とせずに揮発性有機化合物（VOC）の検出を行うことができます。このプロトコルは、SESI - MSを用いて細菌揮発性有機化合物の急速な（数分以内に）評価するための手順について説明します。

二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）を用いて細菌揮発性物質の特性評価

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K ビュー.  University of Vermont. 二次エレクトロスプレーイオン化質量分析法（SESI - MS）は、任意のサンプルの前処理を必要とせずに揮発性有機化合物（VOC）の検出を行うことができます。このプロトコルは、SESI - MSを用いて細菌揮発性有機化合物の急速な（数分以内に）評価するための手順について説明します。

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

生物工学

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

飛行時間型質量分析法と2Dガスクロマトグラフィーを用いて藻類の水熱液化からの水性画分の質的特性評価

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

赤外線マトリックス支援レーザー脱離エレクトロスプレーイオン化することにより、全身質量分析イメージング（IR-MALDESI）

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...