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1。細胞からのサンプル抽出<ol><li>細胞の10センチ板の場合：事前標識を10mlのガラス遠心管にメディアで持ち上げられた細胞懸濁液1.5mlを集める。接着ラインのために、細胞を氷上で保存メディア1.5mlに優しいスクレイピングと解除されるべきオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。 コメント ：細胞代謝のクエンチングは、特定の代謝物のために極めて重要である。時間に敏感な代謝産物の分析のために、このような冷メタノール抽出などの手続きを考慮すべきである。17 </li><li>サンプルを含む10 mLガラス管の各々に6 mlのクロロホルム（CHCl 3中）/メタノール（CH 3 OH）（2:1、v / v）を追加する。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。振盪後、サンプルを4℃で10分間、1,935×gで低加速/減速設定で遠心分離℃で完全に相を分離する。 オプショナル </eM&gt;：CHCl 3中の使用を避けるために、抽出は（CH 2 Cl 2中 ）をジクロロメタンで行うことができる18,12。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。水相の脱塩のために2.6.2に進みまたは直接分析のために4.1に進みます。 </li></ol> 2。血清からのサンプル抽出<ol><li>プラスチック2ミリリットルエッペンドルフチューブに血清を20μlを移しオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。 </li><li> 10秒間CH 3 OH、ボルテックスの190μLを加える。 </li><li> 10秒間のCHCl 3、ボルテックスの380μLを加える。 </li><li>相分離を誘発するために、H 2 Oを120μLを加える。ボルテックスは、10秒間のサンプルと10 RTで平衡化させ分。 </li><li> 4℃で10分間、8,000×gでサンプルを遠心°Cのフェーズを分離する。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに低い有機相を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。 </li><li> 200μlのH 2 Oに再懸濁サンプル酸または塩基試薬（0.1％酢酸、ギ酸、0.1％水酸化アンモニウム）を優先的にpH感受性代謝物を抽出するために使用することができる。完全に再懸濁試料に氷上で20分間超音波洗浄します。 </li><li> 500μlのCH 3 OHでC18スピンカラムをアクティブにします。 </li><li> 500μlのH 2 Oの2回の洗浄とスピンカラムを平衡化した後、サンプルをロードします。酸/塩基試薬が使用される場合、洗浄工程では、この濃度を維持する。 </li><li>サンプルを脱塩する500μlのH 2 Oで洗浄します。酸/塩基試薬を使用する場合は、再度、洗浄、この濃度を維持するステップ。 </li><li>あらかじめ標識クリーン2ミリリットルエッペンドルフチューブにH 2 Oで3 OH CH200μlの80％の2倍量の溶出。酸/塩基試薬が使用される場合、再度、洗浄工程では、この濃度を維持する。 4.1に進みます。 </li></ol> 3。組織からのサンプル抽出<ol><li>組織によっては、凍結した組織の10から100 mgの間で使用。氷浴中で1mlのPBS（1 M、pHが6.8）で予め標識した2ミリリットル低く保持エッペンドルフチューブに組織の全部分を追加してオプション ：内部標準が使用される場合、添加する前に、バッファに追加する組織。 </li><li>各エッペンドルフで30秒間電気ティッシュグラインダーで氷の中に組織をホモジナイズする。試料との間に、それぞれ、CH 3 OHとH 2 Oを含む2つの別々のチューブに組織グラインダーを清掃。 </li><li>あらかじめ標識を10mlのガラス遠心チューブにプラスチックピペットで組織ホモジネートを転送します。転写後、各エッペンドルフチュー​​ブをリンスCH 3 OH 1mlで2倍とガラス管の組織ホモジネートに洗浄を追加します。 </li><li>組織ホモジネートおよびCH 3 OHの洗浄を含む10ミリリットルのガラス管のそれぞれにのCHCl 3 4ミリリットルを追加します。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。 </li><li>振とう後、完全に相を分離し、10分間1,935 xgで低加速/減速設定でサンプルを遠心オプション ：クロロホルムを使用しないように、抽出をCH 2 Cl 2で開発されている。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。 </li><li>長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に水層を転送します。脱塩のために2.6.2に行くか4.1に進みます。 </li></ol> 4。 UPLCのためのサンプルの再懸濁及びろ過<ol><li> SAMPを蒸発させる窒素ガス下レ。 </li><li>再構成は、所望UPLC法（ 表1参照）の出発溶液の適切な量のサンプルを下に乾燥させた。 50〜100μlのは、通常、望ましい再懸濁ボリュームです。優しくボルテックスおよび/または分析物を溶解するのを助けるために上下にサンプルをピペット。 </li><li>サンプルが完全にフィルタ（〜5分）を通過するまで14,000×gで、最大で0.22μmのナイロンチューブフィルタとスピンに試料を移す。試料中に残っている沈殿目に見えるがないことを確認してください。 </li><li>インサート付き予め標識UPLCバイアルにフィルターサンプルの上清を移す。キャップバイアルは、その後サンプルバイアルの底から任意の気泡を除去するためにバイアルをフリック。チルドオートサンプラ（4-5℃）にサンプルを置きます。 </li></ol> 5。 UPLCのセットアップ<ol><li>液体クロマトグラフのための制御ソフトウェアを使用して、に示す条件をベースにして有機試料の実行を作成する<strオング&gt;表1。 。次いで、 任意 の表1に示す条件から水相のための方法を作成して、標的分析物の既知のセットは高い関心がある場合、これらの化合物の重標識アナログを用いUPLC条件を最適化し、これらの条件を使用してメソッドを生成する。 </li><li> UPLCが十分に平衡化することができます。これは、カラムを取り付け、新しいカラムの平衡量（通常3-5カラム容積）については、製造元の指示に従って前に溶剤の完全なプライミングを含める必要があります。将来の問題の診断に役立つ圧力をバック開始のログを維持します。 </li></ol> 6。質量分析計のセットアップ<ol><li>高分解能質量分析計のための制御ソフトウェアを使用して、 表2に示す条件を用いたポジティブモードメソッドを作成します。次に同じ条件を用いて、ネガティブモードメソッドを作成オプション ：標的分析物の既知のセットは、高いintである場合erest、最適ソースおよびこれらの化合物の重標識類似体を用いた光学条件、およびこれらの条件を使用してメソッドを生成する。 </li><li>きれいにし、測定器を校正、分析計に安定したスプレーを確立し、校正液が十分にソースと光学から放散するための時間を可能にします。スプレーの許容安定性は、使用されているLC法と同じ流量でキャリブレーション溶液の注射で少なくとも100スキャンにわたって強度のRSD 3〜5％を与える必要があります。 </li><li>すべてのサンプルのシーケンスを設定し、適切な注入量を設定して、最初のサンプルの前に空白を実行します。サンプル間のキャリーオーバーやマトリックス効果が疑われる場合は、十分な空白/洗浄を実行します。サンプルは、分析によって導入されるバッチの影響を回避するために乱数発生器と鍵を用いてランダム化された方法で設定すべきである。 コメント ：おそらくターゲットの安定同位体標準または分析基準を含む品質管理サンプルはできる信頼性、再現性、および有効な結果のトラブルシューティングと保証する上で極めて貴重。溶媒ブランク続い標準サンプルのみの技術的複製は、ブランクランに信号強度と保持時間のずれだけでなく、キャリーオーバーにアクセスするために使用することができます。 </li><li>シーケンスを開始し、圧力変動、または実行渡る信号強度の損失を含む問題を定期的に監視します。深刻な問題が検出された場合は、実行を停止し、6.2から繰り返す。 </li></ol> 7。微分解析<ol><li> 2つのワークフローは、このプロトコルのために提示されています。最初はSIEVE 2.0、サーモフィッシャーによって販売独自のラベルフリー微分解析ソフトウェアを使用することです。第二ワークフローがXCMSオンライン、スクリプス研究所を通じて、無料のプラットフォームを介して行われます11は 、差動解析を開始する前に、手動でのTICをチェックしたり、ランの再現性を確保するために、サンプル中の任意の既知化合物のフィルタリングクロマトグラムを見てと、すべてのサンプルを通して注入/ UPLC /スプレー安定。 </li><li> SIEVE <ol><li>質量分析計からSIEVEがインストールされているワークステーションのハードドライブに。生データファイルを転送します。 （ 注：それは解析の速度を制限することができるようにネットワーク接続されたポートまたはUSBポート接続されたドライブに保存されたデータのふるいを実行することはお勧めできません。） </li><li> SIEVEを開き、新たな実験を開始します。 </li><li> SIEVEに適切なファイルをロードします。 </li><li>比較群を割り当て、SIEVE、分析のためのパラメータを生成できるように単一の参照ファイルを選択します。 </li><li>プロンプトに従って、個々の実験の要件に従って任意のパラメータを調整します。分析時間を長くすることができますそれは頻繁に戻って、より寛大な設定などのパラメータを緩め、次に厳しいパラメータで開始しすることをお勧めします。 </li><li>パラメータに正または負のモードの正しい付加物リストをロードします。 </li></ol></li><li> XCMSオンライン<ol><li>ファイルを変換するオンラインXCMSの許容形式に。我々のケースでは、我々は形式をmzXMLに変換19 </li><li>オープンXCMSオンライン、およびジョブを作成します。 </li><li>アップロードし、データセットの名前を付けます。唯一の2つのデータセット（ 例えば 、コントロール対トリートメント）スタンドアロンXCMSは頭に頭の比較に限定されているようにアップロードすることができます。 </li><li>ドロップダウンリストから目的の設定を選択します。事前設定のパラメータが異なる計装のセットアップのために利用可能であり、これらは、さらに実験的なニーズに合わせて変更することができます。我々のケースでは、HPLC-Orbi2設定を使用します。 </li><li>ジョブをサブミットして確定します。 </li></ol></li><li>データ解析<ol><li>分析が終了したら、それぞれSIEVEとXCMSフレームと機能のリストについては、移入されます。液晶配向は、任意のランドマークピークを重ねていることを確認してください。アラインされていないLCの実行のいずれかが画期的ピークに大きな偏差を示す場合、これは、サンプルに問題があることを示している場合があります。 オプション ：内部標準が使用される場合SIEVEは、第見つける対応するピークグループと選択したフレームに正規化する。オンラインでXCMSの場合、正規化は、エクスポート後のスプレッドシートで行うことができます。 </li><li>のようなサンプル集団（ 例えば、コントロールサンプル）内の変動係数（CV）によってデータをプロット。大規模CV値は、1つまたは複数のサンプルの問題を示すことができる。希望の特性（ 例えば、p値&lt;0.05、倍の変化&gt; 1.5、グループ内の低い標準偏差など ）に基づいてリストをソートします。 </li><li>グループ間で適切なピークアラインメント、ピーク積分、ガウスピーク形状、信号強度、同位体、及び付加割り当ての各ピークを調べます。 </li><li>さらに分析するために必要に応じてデータをエクスポートしたり、確認との MS n実験用ターゲットマスリストを生成する。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

非標的メタボロミクスは、内因性または生体異物生物変換を調査したり、興味のあるサンプルからの代謝プロファイルを取得するための強力なツールを提供しています。サンプル、生成された大規模なデータセットに対応する能力、および有用な情報（ 例えば、精密質量データベース検索）のデータセットをマイニングする機能を分離して分析するために使用される技術の分解能と感...

HRMSの分野における最近の技術の進歩のために、関連性の低い、仮説生成メタボロミクスのアプローチは、複雑なサンプルの分析に実現可能なアプローチになっています。百万ルーチン低い部分を容易にし10万分解能（ppm）の質量精度が可能な1質量分析計が広くなっている複数のベンダーから入手できる。2,3この質量精度は、分析対象のID、同位体パターン認識、および付加物の識別の予備割り当てに大きな特異性と信頼性を可能にします。4適切な抽出法と高性能LCまたはUPLC、複雑な混合物と結合したときリテンションタイムデータから得られ、追加の特異性を分析することができる。5 UPLCが大きくクロマトグラフィー効率を有する、可能なメタボロームの大きいカバレッジを作る高い感度、解像度、分析時間を可能にする。6得られた大量のデータセットを任意に統合することができ多重差解析ソフトウェアおよび7,8,9,10,11推定されるヒットが最初にピーク検出アルゴリズムの組み合わせ、精密質量ベースの化学式予測、フラグメンテーション予測を用いて同定することができる。有用なパターンや目的の分析物について個々の採掘、および化学データベース検索。このアプローチは、定量化のための現在の金の標準的な方法である研究MS /選択/ UPLCまたは多重反応モニタリング時間のかかる完全な構造の識別に以上に敏感とより具体的な安定同位体希釈の開発のためのターゲットの優先順位付けを可能にします。12 生体試料の様々な性質は、尿13、セル14、血清15、または組織16の抽出プロトコルの最適化につながっている。このプロトコルの特徴抽出細胞、血清、組織のために。適切な場合には、コメントや追加の参照はmodificaのために含まれています安定同位体を含めることに対処するための手順のtions、または特に不安定な代謝物の包含のため。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CM</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (H2O)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W7-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (CH3CN)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A996-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A464-4</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (CH3Cl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td>Hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (CH2Cl2)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>61030-1000</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl Ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td>To replace chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid (FA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4OH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A470-250</td>
			<td>(optima)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate (HCOONH4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>78314</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSpin C18 Columns</td>
			<td>Nest Group Inc</td>
			<td>SS18V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Glass Centrifuge Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>73785-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>CLS-4301-015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>60000751CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Inserts (glass)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT094171</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC Vials (plastic)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002640</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &mu;m Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8169</td>
			<td>nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf Tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>C-3229-1</td>
			<td>Low Retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LTQ XL-Orbitrap</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC/UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>nanoACQUITY UPLC</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source</td>
			<td>Michrom</td>
			<td>Thermo Advance Source</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential Analysis Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SIEVE 2.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoACQUITY C18 BEH130</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003546</td>
			<td>1.7 &mu;m particle size, 150 mm x 100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acentis Express C8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>54262</td>
			<td>2.7 &mu;m particle size, 15 cm x 200 &mu;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted metabolomics from biological sources using ultraperformance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (uplc-hrms)

ここでは含めて興味のある生物学的サンプルのための代謝プロファイルを分析するためのワークフローを提示し、細胞、血清、または組織。試料を最初に液 - 液相抽出により極性および非極性画分に分離され、部分的に下流の分析を容易にするために精製される。水溶液（極性代謝物）と初期抽出の有機的（非極性代謝物）のフェーズの両方が代謝物の広い範囲を調査するために処理される。代謝産物は、そのパーティション特性に基づいて異なる液体クロマトグラフィー法により分離される。この手法では、マイクロ超性能（UP）LC方法を提示したが、プロトコルがより高い流量と低い圧力に適合している。質量分析計への導入は、一般的な最適化された化合物または元の条件のいずれかを使用してすることができます。イオンの広い範囲の検出は、最近、Cでの高解像度を使用して幅広いのm / z範囲にわたって正と負の両方のモードにおいてフルスキャンモードで行われるalibrated楽器。ラベルフリー差分解析は、バイオインフォマティクスプラットフォーム上で実施される。このアプローチのアプリケーションは、代謝経路のスクリーニング、バイオマーカー探索、及び薬剤開発が含まれています。

示された結果は、農薬やミトコンドリア複合体I阻害剤ロテノンとSH-SY5Y神経膠芽腫細胞の6時間の処理から選択したデータを示す。簡潔にするために、唯一の有機相ポジティブモードデータが提示される。サンプルが処理され、上述したように分析した（ 図1、表1、表2）とラベルフリー定量化、およびSIEVE XCMSオンラインで2つの差解析プラットフォーム上にロードした。ヒットの?...

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Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 - 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調査している。

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

22.2K ビュー.  University of Pennsylvania. 非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 - 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調?...

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

化学

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

水素交換質量分析法を用いてタンパク質のダイナミクスを分析する

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

高分解能質量分析に結合された二次 Nanoelectrospray イオン化を用いたリアルタイム呼吸解析

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

生きているカエル (アフリカツメガエル) 胚の単一細胞メタボロミクスのマイクロ プローブ キャピラリー電気泳動質量分析法

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

マルチ セグメントの注入キャピラリー電気泳動質量分析法による高スループットかつ包括的な薬物監視

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

飛行時間二次イオン質量分析を用いた金属塗料界面での腐食イメージング

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

3D Depth Profile Reconstruction of Segregated Impurities Using Secondary Ion Mass Spectrometry

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial resolution (~1 &#181;m). Furthermore, it describes how to obtain realistic three-dimensional (3D) distributions of segregated impurities/dopants in solid state materials. Direct 3D depth profile reconstruction is often difficult to achieve due to SIMS-related measurement artifacts. Presented here is a method to identify and solve this challenge. Three major issues are discussed, including the i) nonuniformity of the detector being compensated by flat-field correction; ii) vacuum background contribution (parasitic oxygen counts from residual gases present in the analysis chamber) being estimated and subtracted; and iii)&#160;performance of all steps within a stable timespan of the primary ion source. Wet chemical etching is used to reveal the position and types of dislocation in a material, then the SIMS result is superimposed on images obtained via scanning electron microscopy (SEM). Thus, the position of agglomerated impurities can be related to the position of certain defects. The method is fast and does not require sophisticated sample preparation stage; however, it requires a high-quality, stable ion source, and the entire measurement must be performed quickly to avoid deterioration of the primary beam parameters.

The presented method describes how to identify and solve measurement artifacts related to secondary ion mass spectrometry as well as obtain realistic 3D distributions of impurities/dopants in solid state materials.

二次イオン質量分析を用いた分離不純物の3D深さプロファイル再構成(英語)

The presented protocol combines excellent detection limits (1 ppm to 1 ppb) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) with reasonable spatial ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析のためのシアノバクテリアからの非タンパク質アミノ酸の抽出(英語)

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...