我々は、資金調達（S.シュワルツ）と援助（K. Spragens、T.グラハム）のための技術サポートとUSGS西部生態研究センターのためにM.皿洗いとアイダホテクノロジーのR.クリスプを感謝したい。防衛や空軍研究所の部門の支援の防衛と国土安全保障研究所（www.idhs.org）、 - この研究は、革新的技術センターの後援の下に行われた。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この出版物の貿易、製品、または企業の名前のいずれかを使用するには、説明の提供のみを目的としており、米国政府による是認を意味するものではありません。

1。ミストのネットを使用して野生の鳥の捕獲<ol><li>シギチドリ類の捕獲の場合は、このような湿地、海岸線、または干潟のようなアクティブな採餌場所でミストネットを設定する。 </li><li>スライドトランメルのラインは、ポールの周りに霧のネットの一端のループと泥に垂直にポールを挿入します。 </li><li>ネットを伸ばし、ミストのネットの他の端にトランメルのループを介し番目の極を挿入し、垂直にトランメルのラインが教えていることを確認しながら、泥に棒を挿入。 </li><li>鳥がキャプチャされると、ネットから鳥を抽出し、バンディングステーションに戻ります。 </li></ol> 2。総排泄腔スワブのサンプリング<ol><li>撮影直後の総排泄腔スワブを収集する</li><li>排出腔を見つけて、周囲の羽毛をプッシュバックする指先を使って</li><li>滅菌ダクロンまたはポリエステル先端綿棒をラップ、第一の端部をステム、およびスワブでより容易にするために滅菌ウイルス輸送媒体と先端を湿らせ。湿潤した後、綿棒の頭全体を穏やかに排出腔に挿入されます。ゆっくり綿棒をくるくると総排泄腔から綿棒を削除することにより総排泄腔のスワブは、内側の円周。 </li><li>ウイルス輸送のメディアのサンプルバイアルに直接綿棒の先端を挿入、綿棒がメディアにある間、親指と人差し指の間に綿棒シャフトを回転させる。アシスタントは、バイアルの底から戻って綿棒の先端を引いて手順〜1 cmを完了し、綿棒の先端がバイアルに残っているとシャフトが干渉しないようにハサミで綿棒の軸を待ち構えているキャップ閉鎖。しっかりとキャップのバイアル。綿棒の軸を切断の間にアルコールではさみを消毒する。 </li><li>ドライアイスやアイスパックのいずれかを含む冷凍ボックスにバイアルを置きます。 </li></ol> 3。口腔咽頭スワブのサンプリング<ol start="1"><li>後鼻孔スリットが見えるように優しく鳥のくちばしを開いて</li><li>パッケージから綿棒をラップ、第一の端部をステム、およびスワブでより容易にするためにウイルスの輸送媒体と先端を湿ら</li><li>他の表面に先端に触れることなく、口と綿棒口の屋根の上に後鼻孔の開口部に挿入し、咽頭や喉の領域に向かって戻って続ける</li><li>直接ウイルス輸送のメディアバイアルに綿棒の先端を置きます。綿棒がメディアにある間に親指と人差し指の間に綿棒シャフトを回転させる。上記のように、アシスタントがバイアルの底から綿棒の背面の先端部約1 cmをプルし、綿棒の先端がバイアルに残っているとシャフトがキャップに干渉しないようにハサミで綿棒の軸を待ち構えている閉鎖。しっかりとキャップのバイアル。綿棒の軸を切断の間にアルコールではさみを消毒する。 </li><li>ドライアイスやアイスパックを含む冷凍ボックスにバイアルを置きます。 </li></ol> 4。鳥の扱いとリリース<ol start="1"><li>タイムリーに（&lt;20分）でのキャプチャとリリースのサイトに鳥を返します。ハンドラは、動物福祉の原則を認識し、（すなわち擦り傷、ミオパシーや低刺激や温熱療法を取り込む）、サンプリング中に苦しんでいる鳥の兆候を警戒しなければならない。基本的な救急箱は、機器のリストに含まれる必要があります。 </li></ol> 5。試験設備<ol start="1"><li>サンプルは、PCR装置と接続されたコンピュータを実行するための電源（電圧安定化電源の発電機）で、このような研究のトレーラーやテントなどの密閉空間でテストすることができます。 </li></ol> 6。 RNA抽出<ol start="1"><li> RNAの抽出は、スパックマンら以下のメーカーの指示に若干変更してRNeasyミニキットで行われた1。 </li><li>渦3月5日のための綿棒培地2 mlのマイクロチューブに350μlを移す。注：PCR陽性検体は、再スクリーニングする必要があるかH5のテストを実行する必要がある場合には氷の上で、残りのサンプルを保管してください。 </li><li> 350 RLTバッファーの液（β- MEを含む）、5秒間ボルテックスを追加します。 </li><li> RNAグレードの70％エタノール350μlを添加する。 </li><li> 5分間5000 × gで遠心する。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブに配置されたスピンカラムに上清600μlを添加する。試験管ラック内の残りのサンプルを保持する。 </li><li> 10,000 xgで20秒間遠心とフロースルー捨てます。 </li><li>すべてのサンプルをスピンカラムを通過されるまで繰り返します17-18繰り返します。 </li><li>きれいな2 mlのコレクションチューブにスピンカラムをセット。 </li><li>スピンカラムにRW1バッファー700μlを加え、10,000 × gで25秒遠心しフロースルーを捨てる。 </li><li> 10,000 × gで25秒用スピンカラムや遠心に500μlのRPEバッファーを追加します。フロースルーを捨てる。 </li><li> RPEバッファーで2回洗浄の合計のためのステップ22を繰り返します。 </li><li> 14,000 × gで追加の2分間のスピンカラムを遠心コレクションチューブを捨てる。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムをセットし、ヌクレアーゼフリー水50μlのを追加します。 60秒室温でインキュベート</li><li>万xgfで60秒間回転させて溶出RNAまたは60秒場所は、氷上でサンプルを精製する。 </li></ol> 7。ネガティブコントロールの準備<ol start="1"><li>凍結乾燥試薬はTaqManプローブインフルエンザターゲット1（Asay氏 - ASY - 0109）のためのアイダホテクノロジー凍結乾燥試薬の検出キットからの指示に従ってPCRアッセイで使用するために調製した。 </li><li>ペレットが下部になってしまうため3秒のための陰性コントロール試薬バイアル（赤）を遠心してください。 </li><li>キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。 </li><li> 2 Xの再構成バッファと20μlの試薬グレード水20μlを添加する。 </li><li>最大速度で5秒要約と渦。 </li><li>バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。 </li><li>視覚的にペレットをチェックする手順31から32を繰り返していない場合、再水和している。 </li><li>ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。 </li></ol> 8。準備テストサンプル<ol start="1"><li>ペレットが下部になってしまうため3秒間不明試薬のバイアル（青）を遠心してください。 </li><li>キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。 </li><li>精製したRNA 40μlを添加する。 </li><li>最大速度で5秒要約と渦。 </li><li>バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。 </li><li>視覚的にペレットをチェックする手順38から39を繰り返していない場合、再水和している。 </li><li>ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。 </li></ol> 9。ポジティブコントロールの準備<ol start="1"><li>ペレットが下部になってしまうため3秒のための陽性対照試薬バイアル（緑）を遠心してください。 </li><li>キャップを外し、視覚的にペレットが底にあることを確認してください。 </li><li> 2 Xの再構成バッファと20μlの試薬グレード水20μlを添加する。 </li><li>最大速度で5秒要約と渦。 </li><li>バイアルの底に液体をもたらすために3秒間遠心します。 </li><li>視覚的にペレットをチェックする手順45から46を繰り返していない場合、再水和している。 </li><li>ピペットライトサイキャピラリーチューブに水和液の19μlを、重複を取得する2番目のキャピラリーにピペットのステップを繰り返します。 </li></ol> 10。キャピラリーチューブを遠心分離し<ol start="1"><li>一度にすべてのバッチのためのキャピラリーチューブのは、キャピラリーのアダプタを装備したミニ遠心機にそれらをロードする準備されている。 </li><li> 1秒のパルスボタンを押すことで最小の設定で遠心これはテストの準備のために底に液体が転送されます。 </li></ol> 11。 RAPIDを操作する<ol start="1"><li>新しいファイルを作成します。ラベルポジティブコントロール、ネガティブコントロール、そして試料（それらのID番号によって）。 </li><li>プログラム1：RNAサンプルの調製ホールド<ol><li>サイクル数= 1 </li><li>分析モード=なし</li><li>ターゲットの温度= 40 </li><li>インキュベーション時間= 30分</li><li>温度遷移レート= 20 ° C /秒（デフォルト） </li><li>二次温度ターゲット= 0（デフォルト） </li><li>ステップサイズ= 0（デフォルト） </li><li>ステップ遅延= 0（デフォルト） </li><li>アクイジションモード=なし（デフォルト） </li></ol></li><li>プログラム2：RNA変性<ol><li>サイクル数= 1 </li><li>分析モード=なし</li><li>ターゲットの温度= 94 </li><li>インキュベーション時間= 120秒</li><li>温度遷移レート= 20 ° C /秒（デフォルト） </li><li>二次温度ターゲット= 0（デフォルト） </li><li>ステップサイズ= 0（デフォルト） </li><li>ステップ遅延= 0（デフォルト） </li><li>アクイジションモード=なし（デフォルト） </li></ol></li><li>プログラム3：RNAの増幅<ol><li>サイクル数= 45 </li><li>分析モード=自動解析</li><li>ターゲット温度、セグメント1 = 94、セグメント2 = 60 </li><li>インキュベーション時間、セグメント1 = 0秒、セグメント2 = 20秒</li><li> 1＆2をワンセグ温度遷移レート、= 20 ° C /秒（デフォルト） </li><li>二次温度ターゲット、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト） </li><li>ステップサイズ、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト） </li><li>ステップ遅延、ワンセグ1＆2 = 0（デフォルト） </li><li>アクイジションモード、=なしセグメント1、セグメント2 =シングル</li></ol></li><li>蛍光パラメータ<ol><li>表示モード：蛍光チャネル2（CH2 / 1） ゲイン： <ol><li>チャネル1（F1）= 1 </li><li>チャンネル2（F2）= 8 </li><li> CH 3（F3）= 1 </li></ol></li><li>各サンプルのリアルタイム蛍光データを表示するには、関心のサンプルを選択し、画面下部の&quot;グラフの表示&quot;ボタンをクリックします。 </li></ol></li><li>それぞれのキャピラリーの場合、結果は次のとおりです。 <ul><li> ＃ - カルーセルのカルーセル位置を識別します。 </li><li>サンプル名は、 - サンプルの名前を提供します。 </li><li>制御 - 各サンプルのサンプルの種類が識別</li><li>スコア - サンプルの蛍光と、試料中のバックグラウンド蛍光のレベルとの関係を用いて計算</li><li>結果は - サンプルの全体的な結果が表示されます。 </li></ul></li></ol> 12。代表的な結果： 現在：テスト/未知のサンプルの赤&quot;現在&quot;の呼び出しは、ターゲットがそのサンプルに識別し、コントロールが正常に行われたされたことを示します。 検出されない：テスト/未知のサンプルのための緑の&quot;検出されない&quot;の呼び出しは、ターゲットがそのサンプルに識別し、テストのコントロールが成功したされていないことを示します。 繰り返してください：&quot;してください繰り返しますが&quot;正または負の制御が失敗したことを示します。 RAPID 7200で成功した解析の例を図4に示されています。ポジティブコントロールは増幅され、約25サイクル（x軸）で検出可能な蛍光（y軸）を生成しています。サイクル閾値（CT）&gt; 35ほとんどのAIVのリファレンス研究施設のための合意されたカットオフです。したがって、このメソッドのポジティブコントロールには、AIVの検出のためのサイクルの受け入れ数（0から35）内の蛍光シグナルを作り出した。対照的に、ネガティブコントロールでも45サイクル後の蛍光シグナルを生成しません。同様に、西部のシギから収集twelveのサンプルは、鳥がAIVのために陰性であることを示す蛍光シグナルを生成しませんでした。従来の実験室内のすべての陽性試料のフォローアップ試験は、偽陽性が誤って生成されないことを保証するために推奨されています。 <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="図1" /> ミストのネットを用いて図1。シギチドリ類の捕獲。 <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。少なくともシギから総排泄腔と咽頭サンプルのコレクション。 <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。RNA増幅のためにRAPID 7200をプログラミング。 <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。RAPID 7200ポータブルRRT - PCRは、どのようにポジティブとネガティブコントロールを示すことによって生成されたFluorogramは成功したアッセイに表示されます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">フルサイズの画像を表示するにはここをクリック</a>

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	<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds:+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents.">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li><li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. 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P., Stilianakis, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecologic+immunology+of+avian+influenza+(H5N1)+in+migratory+birds.">Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).</li><li>Kim, J. -. K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. 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利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する迅速な診断の方法は、AIVのサーベイランスのための野生の鳥のサンプルの時間効率と正確なテストを容易にします。液体窒素の荷主またはドライアイスが使用できない場合は、コールドチェーンの維持が不可能な場合がありますどこポータブルRRT - PCRのはるかに少ない厳しい試料のストレージ要件は、リモートの状況に適しています。さらに、我々は実験室ベースの分子解析?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> RNeasyミニスピンカラム</td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td>コレクションチューブ（1.5＆2 mL）中</td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td>バッファRLT </td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td>バッファRW1 </td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td>バッファーRPE </td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td> RNaseフリー水</td><td>キアゲン</td><td> 74106 </td><td> RNeasyミニキットに含まれる</td></tr><tr><td> 14.3 Mβ-メルカプトエタノール溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100％エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td>渦魔神2、120V </td><td>サイエンティフィックインダストリーズ</td><td> SI - 0236 </td><td></td></tr><tr><td>タックマンインフルエンザターゲット1（加水分解プローブ） </td><td>アイダホテクノロジー</td><td> Asay氏 - ASY - 0109 </td><td></td></tr><tr><td>ライトサイ20ミリリットルキャピラリーチューブ</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mlのチューブ用ローテーター付きマイクロ遠心</td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> RAPIDキットに含まれています</td></tr><tr><td>耐久性の高い高度な病原体識別装置（RAPID）7200 </td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> RAPIDキットに含まれています</td></tr><tr><td> Windows XP Professionalを搭載したPentiumベースのラップトップ</td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> RAPIDキットに含まれています</td></tr><tr><td>ライトサイデータ解析ソフトウェア</td><td>アイダホテクノロジー</td><td></td><td> RAPIDキットに含まれています</td></tr></tbody></table>

rapid diagnosis of avian influenza virus in wild birds: use of a portable rrt-pcr and freeze-dried reagents in the field

野生の鳥は渡り鳥フライウェイに沿って監視を促す、H5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）の拡散に関与している。鳥インフルエンザウイルス（AIV）のための野鳥のサンプリングは、多くの場合、遠隔地で行われているが、結果はしばしば分子検査のために装備研究所にサンプルを輸送する必要が遅延されています。リアルタイムの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RRT - PCR）は、AIVの診断のための最も正確で高感度のいずれかの方法を提供する分子技術です。 RRT - PCRに必要な以前に厳格な実験室のプロトコルは現在、フィールドに適応されている。ウェット試薬のレベルでの感度を持つコールドチェーンを必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）試薬の開発は、実用的な目標に、サイト上のリモートテストをもたらしています。 ここでは、凍結乾燥試薬を採用したRRT - PCRユニット（高耐久性高度病原体識別装置またはRAPID、アイダホテクノロジー、ソルトレイクシティ、ユタ州）（インフルエンザターゲット1タックマンを使用して野鳥のAIVの迅速な診断のための方法を提示する。Asay氏を - ASY - 0109、アイダホテクノロジーズ）。不適切な保管やウェット試薬の取り扱いに関連するエラーを排除し、プライマー、プローブ、酵素、緩衝液および内部陽性対照：試薬は、単一のチューブ内で適切な濃度でテストするために必要なすべてのコンポーネントが含まれています。ポータブルユニットは、2〜3時間でマトリックスの遺伝子と収量の結果を標的とすることでインフルエンザのための画面を実行します。遺伝的サブタイピングは、H5やH7プライマーでも可能です、そのターゲットの血球凝集素遺伝子を設定します。 システムは、渡り鳥シギチドリ類の種をここに示すように、野生の鳥から採取した、ヒメハマシギ（Calidrusマウリ ） は 、カリフォルニア北部でキャプチャされた総排泄腔と咽頭サンプルの使用に適しています。動物の扱いは、米国地質調査所西部生態学研究センターと実験室をバンディング米国地質調査所の鳥の許可の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従った。この技法の主な利点は、遠隔地での発生を含んでいる可能性を高める、野鳥の診断を促進することです。オンサイト診断も、野生の個体群に感染した個体を識別し、研究するために有用であることが分かるでしょう。ホストの生物学（感染症に対する免疫学的および生理学的応答）と空間的な生態学（感染した鳥の渡り​​鳥パフォーマンス）に関する情報を収集する機会は、野生の鳥が長距離のAIVのためのベクターとして動作できる範囲についての洞察を提供します。

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Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

本研究では、ポータブルRRT - PCRシステムを使用して、野鳥における鳥インフルエンザの診断について説明します。方法は、アウトブレイクのシナリオの典型的な非実験室の設定で野鳥をスクリーニングするために凍結乾燥試薬、を活用しています。分子ツールの使用は、迅速な診断のための正確かつ敏感な選択肢を提供します。

野鳥の鳥インフルエンザウイルスの迅速な診断：フィールドのポータブルRRT - PCR及び凍結乾燥試薬の使用

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K ビュー.  USGS Western Ecological Research Center. 本研究では、ポータブルRRT - PCRシステムを使用して、野鳥における鳥インフルエンザの診断について説明します。方法は、アウトブレイクのシナリオの典型的な非実験室の設定で野鳥をスクリーニングするために凍結乾燥試薬、を活用しています。分子ツールの使用は、迅速な診断のための正確かつ敏感な選択肢を提供します。

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

免疫・感染学

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

フィールドメソッド、バイオセーフティ、および交通の問題解決：FTAカードによる鳥インフルエンザのサーベイランス

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.