Name: influenza virus propagation in embryonated chicken eggs
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
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The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

注：総論：無菌条件下で卵の操作に関連するすべての手順を実行し、滅菌技術がそれに応じて使用する必要があります。使用前に70％エタノールを用いたプレクリーンなすべての機器。一般的には、インフルエンザウイルス接種および収穫はBSL-2の実験室で実施されるべきである。しかし、このプロトコルは、多くの病原性インフルエンザウイルス（ 例えば 、パンデミックおよびプレパンデミック株は、家禽および家畜への危険をもたらす菌株、高病原性鳥インフルエンザ株、1918 H1N1株）、高い生物学的安全性レベルを伝播するために使用された場合にいくつかのケースでは、バイオセキュリティの注意事項および権限が必要です。地元の機関バイオセーフティ委員会は、インフルエンザウイルスが関与するすべての研究を承認する必要があります。 接種のための卵の調製<ol><li>適切なベンダーからの血清病原体フリー（SPF）たての受精卵鳥類の卵を入手します。一般的に、ニワトリの卵が使用されます。卵は私たちでなければなりません到着後すぐにエド。 </li><li>定期的に卵を回転させる自動卵ターナー加湿卵のインキュベーターで到着地の卵時に。自動卵ターナーが使用できない場合は、手動で（手袋を着用し、できるだけ無菌のすべてを維持することを確認してください）​​は、少なくとも1日2〜3回卵を回転させる。 </li><li> 10〜11日間、37℃で55〜60％の湿度で卵をインキュベートする。 </li></ol> 2.検卵<ol><li>インキュベーションの約7〜8日後にキャンドリングによって不妊のための卵を確認するために、暗い部屋で明るい光に対して卵を検査するために卵キャンドラーを使用してください。 <ol><li> 70％エタノールで卵キャンドラーを拭きます。多くの場合、手袋を変更して病原体による汚染の危険性を最小限にするために70％エタノールで消毒する。 </li><li>インキュベーターから卵を取り出し、空の卵のカートンに配置します。 </li><li>部屋の照明をオフにします。 </li><li>キャンドラーに対して一度に各卵1の大端を持ってください。 </li><li>決定する際に、卵を守ってEそれは肥沃または不妊の場合は。 注：豆の形胚につながる細い血管がはっきりと見えるはずです。未受精卵は、目に見える卵黄の小さな血液スポットとして表示されます。 </li></ol></li><li>未受精卵である卵を破棄し、インキュベーターに実行可能な卵を返す。 30分以上のためのインキュベーターの外に卵を放置しないでください。卵の状態が確認できない場合は、それをマークし、後でそれを観察する。 </li></ol>ウイルス接種の調製<ol><li> 10 mMのHEPES（pHは7.4）を含有する滅菌PBS中で10 4 pfu / mlで-約10 3インフルエンザウイルスストックを希釈する。重要なステップ：使用直前にウイルスストックを希釈し、氷の上のすべての時間を希釈したウイルスを保つ。 </li></ol>尿膜経路を介し4.インフルエンザウイルス接種<ol><li>ウイルス接種（10日または11）の日には、再び卵をキャンドル、デッド胚を排除する。ライブ胚を区別する卵内部の動きを探して。 </li><li>インキュベーターから3卵を取り出し、気嚢を上にして別々のホルダーに卵を配置する。 </li><li>永久的なマーカーで卵のエアスペースをマークします。 </li><li> 70％エタノールで空気層の上に卵の殻を洗ってください。 </li><li>卵のカートンとバイオセーフティーフード（BSL-2）への空気のスペースを上にして卵を入れてください。 </li><li>各卵の気嚢上の殻に小さな穴をパンチするために無菌の18G針を使用してください。胚または卵黄を刺し避けるためにあまりにも深く針を挿入しないように注意してください。 </li><li>無菌の1mlシリンジに希釈したインフルエンザウイルスを策定し、22Gの針を取り付けます。 </li><li>尿膜腔に45°の角度で針で注射器を慎重に進める。 </li><li>希釈されたインフルエンザウイルスを0.2ml注入する。 </li><li>他の二つの卵を注射を繰り返し、その後、注射器と針を捨てる。 </li><li>グルーガンから接着剤の滴（または溶融パラフィンワックス）で穴をシール。 B電子接着剤が卵の中に漏れないように注意してください。 </li><li>エアスペースを上に指摘して卵のインキュベーターに卵をバックに配置します。 </li><li>すべての卵が接種されてきたまでは4.12 - を繰り返して、4.2を繰り返します。 </li></ol> 5.培養時間<ol><li> 37℃、〜60％の湿度で切らずに感染した卵をインキュベートする。 </li><li>インフルエンザウイルスの種類に応じて最適なインキュベーション時間を選択する。 48時間インフルエンザAをインキュベートする。 72時間インフルエンザBとCをインキュベートする。 </li></ol> 6.インフルエンザウイルスの収穫<ol><li>インキュベーション期間の後、胚を死滅させ、血液に感染した尿膜液を汚染する危険性を低減するために、血管を収縮するために4時間（またはO / N）の最小4℃で卵を冷やす。収量が減少したウイルスを、吸収するから赤血球を防ぐためにこれを行います。 -20℃で30分間、あるいは、冷却卵。しかし、これは血液汚染のリスクを増大させる。 </li><li>卵が十分に冷えたされた後に、バイオセーフティフードに卵を移す。気嚢が上を向くようにしてしっかりしたホルダーに卵を置きます。 70％エタノールで卵の表面を清掃してください。 </li><li>気嚢の上に卵の殻を開くために、無菌のハサミを使用してください。漿尿膜を破壊しないように注意しながら気嚢の周りにシェルを削除します。 </li><li>無菌の鈍鉗子で絨毛尿膜を開きます。そっと小さなへらやスプーンを持つ胚と卵黄嚢を脇に移動します。卵黄を破裂しないように注意してください。 </li><li> 1ミリリットルエッペンドルフピペットを用いて、慎重に尿膜液を集める。必要に応じて、できるだけ多くの液体を収集するためにビット側に卵を傾ける。 </li><li> 50ミリリットルプラスチック製コニカルチューブにすべての卵から尿膜液を組み合わせる。ウイルス収集中、常に氷上にチューブを保管してください。わずかに黄色がかった流体10mlの - One卵利回り5。 </li><li> 4で10分間千×gでウイルス含有尿膜液をスピン6; Cは破片をペレット化する。新しい50mlチューブに透明な流体を移送氷上に保持。 BSL-2廃棄物容器に卵を処分してください。 </li></ol> 7.ストレージ<ol><li>すぐに明らかになっ尿膜液（ 例えば、50、100または500 ulのアリコート）をアリコートし、スナップ凍結し、液体窒素中。凍結されたウイルスストックの長期保存のために-80℃の冷凍庫に転送します。 </li></ol>

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	<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States,+1976-2007.">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li><li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus.">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li><li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus:+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice.">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li><li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+and+the+challenge+for+immunology.">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li><li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuing+challenges+in+influenza.">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li><li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+15G.1+Influenza:+propagation,+quantification,+and+storage.+.">Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. .</a> Current protocols in microbiology. , (2006).</li><li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome.">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li><li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection.">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li><li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses.">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells).">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

インフルエンザは、疾患の大規模なグローバル負担が発生し、作業が肺損傷7の病因を理解することに継続する。この致命的な疾患で容易に研究し、種々の方法は、インフルエンザウイルス6を伝播するために開発されている。ここでは、鶏卵中でインフルエンザウイルスを製造する技術が記載されている。この方法の利点は、それが高度に再現可能であることであり、多くの<...

インフルエンザAは、ヒトの健康に対する大きな脅威であり続けている。これは、大規模なグローバルな負担が世界中で毎年150万の死亡までの原因と潜在的に壊滅的な呼吸器疾患である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科にあり、それらのゲノム1,2- 8ネガティブセンス一本鎖RNAを運ぶ。ウイルスゲノムの高い可変性（ すなわち 、抗原性「ドリフト」）は、長期的な免疫を防ぐことができます。また、インフルエンザは、抗ウイルス薬3にますます抵抗性がある。 2009年新型インフルエンザのパンデミックは、インフルエンザ疾患（パンデミック株、抗ウイルス耐性、遅延ワクチン製造）に関連するすべての困難な問題を強調した。ワクチン製剤は最も可能性の高い病原性インフルエンザ株4（H1N1、H3N2およびB型インフルエンザ用に1つずつ）のために世界保健機関が毎年決定 ​​されます。この方法は、予測されたインフルエンザ株に基づいているのでsは、病原性株は時折間違って識別され、ワクチンの有効性は劇的に低下する。また、新型インフルエンザ株の出現はパンデミック病気2を引き起こすこれらの予防プログラムを回避することができます。 ユニバーサルインフルエンザワクチンの作成 ​​は5とらえどころのないされている。そのため、研究は肺損傷の病因の理解に続けなければならない。施設研究室の研究のために、いくつかの方法は、ウイルスの単離および増殖6のために開発されている。ヒトインフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞、種々の基材に増幅することができる。しかし、大量に発生する高力価のウイルスは、最高の孵化卵内で達成される。以下のプロトコルは、インフルエンザのために既存のウイルスストックからのウイルスの伝播とストレージを技術が記載されている。

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Cellgro&amp;nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&amp;nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidified egg incubator&amp;nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatic egg turner</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>egg candler</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>diluted to 70% using water</td></tr><tr><td>glue gun &quot;Ad tech Hi Temp Project Pro&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>glue &quot;Ad tech MINI SIZE, Multi Temp&quot;</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus propagation in embryonated chicken eggs

インフルエンザ感染は約36000人が死亡、米国では20万人以上の入院毎年と関連している。突然変異再類別による新しいインフルエンザウイルス株の連続的な出現は、ウイルスの制御を複雑にし、新規薬剤およびワクチンの永久的な開発を必要とする。インフルエンザの実験室ベースの研究では、ウイルスの増殖のための信頼性とコスト効果的な方法が必要です。ここで、総合的なプロトコルは、一貫して高い力価のウイルスストックをもたらす肥沃鶏卵におけるインフルエンザAウイルスの増殖のために提供される。 11日目 - 要するに、血清病原体フリー（SPF）ニワトリ受精卵を37℃、10 55〜60％の湿度でインキュベートする。この期間、胚発生を容易に卵キャンドラーを用いてモニターすることができる。ウイルス接種針を用いて、尿膜腔へのウイルスストックを注入することにより行われる。 37℃でのインキュベーションの2日後、卵は4℃で少なくとも4時間冷却した。気嚢と漿尿膜上卵殻を注意深く開かれ、ウイルスを含む尿膜液を採取する。流体は、遠心分離によってデブリからクリア等分し、長期保存のために-80°Cに転送される。大量（卵あたりウイルス液5-10）に溶解し、通常、このプロトコルを用いて達成される、高ウイルス力価は、ウイルス調製物のために大量に必要とするin vitro試験のために、特に我々の有利な方法は、卵の使用を行っているウイルスの同じウイルスストックの高用量が必要とされている。

複数の方法は、インフルエンザウイルスを滴定するために開発されている。適切な方法を選択する一つの考慮事項は、他の人が実行可能なビリオンを評価する感染性、（ 例えば 、プラークアッセイ）6に基づいているのに対し、いくつかは関係なく実行可能性（ 例えば 、赤血球凝集素アッセイ）の合計粒子を決定することである。ここでは、マウス適合インフルエンザ...

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

43.0K ビュー.  Cedars-Sinai Medical Center. Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

がん研究

Using Chicken Embryo as a Powerful Tool in Assessment of Developmental Cardiotoxicities

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is well-defined, and it is relatively easy to achieve precise and timely exposure via multiple methods. Moreover, the process of heart development in chicken embryos is similar to mammals, also resulting in a four-chambered heart, making it a valuable alternative model in the assessment of developmental cardiotoxicities. In our lab, the chicken embryo model is routinely used in the assessment of developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental pollutants, including per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), particulate matter (PMs), diesel exhaust (DE) and nano materials. The exposure time can be freely selected based on the need, from the beginning of development (embryonic day 0, ED0) all the way to the day prior to hatch. The major exposure methods include air-cell injection, direct microinjection, and air-cell inhalation (originally developed in our lab), and the currently available endpoints include cardiac function (electrocardiography), morphology (histological assessments) and molecular biological assessments (immunohistochemistry, qRT-PCR, western blotting, etc.). Of course, the chicken embryo model has its own limitations, such as limited availability of antibodies. Nevertheless, with more laboratories starting to utilize this model, it can be used to make significant contributions to the study of developmental cardiotoxicities.

Chicken embryos, as a classical developmental model, are used in our lab to assess developmental cardiotoxicities following exposure to various environmental contaminants. Exposure methods and morphological/functional assessment methods established are described in this manuscript.

発達的心毒性の評価における強力なツールとしての鶏胚の使用

Chicken embryos are a classical model in developmental studies. During the development of chicken embryos, the time window of heart development is ...

発生生物学

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

生物学

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering exogenous materials into chicken embryos has a great advantage for studying gene function, transgenic breeding, and chimera preparation during embryonic development. Here we show the method of in ovo intravascular injection whereby exogenous materials such as plasmid vectors or modified primordial germ cells (PGCs) can be transferred into donor chicken embryos at early developmental stages. The results show that the intravascular injection through the dorsal aorta and head allows injected materials to diffuse into the whole embryo through the blood circulatory system. In the presented protocol, the efficacy of exogenous plasmid and lentiviral vector introduction, and the colonization of injected exogenous PGCs in the recipient gonad, were determined by observing fluorescence in the embryos. This article describes detailed procedures of this method, thereby providing an excellent approach to studying gene function, embryo and developmental biology, and gonad-chimeric chicken production. In conclusion, this article will allow researchers to perform in ovo intravascular injection of exogenous materials into chicken embryos with great success and reproducibility.

In Ovo Intravascular Injection in Chicken Embryos

The overall goal of this paper is to describe how to perform in ovo intracellular injection of exogenous materials into chicken embryos. This approach is very useful to study the developmental biology of chicken embryos.

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

As a classical model system of embryo biology, the chicken embryo has been used to investigate embryonic development and differentiation. Delivering ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

要約

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プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

発達的心毒性の評価における強力なツールとしての鶏胚の使用

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

オヴォでニワトリ胚における血管内注射

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

要約

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プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

アラントイック液からの高力価組換えニューカッスル病ウイルスの生産

発達的心毒性の評価における強力なツールとしての鶏胚の使用

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

オヴォでニワトリ胚における血管内注射